Bacillus sp. BSD-8肌酐降解酶系的研究

论文摘要

在临床测定中,血清中的肌酐浓度是一项判断肾功能的重要指标。酶法测定肌酐浓度,具有反应专一性强和灵敏度高等特点。本实验室已从土壤中筛选到产肌氨酸氧化酶（SOX）的芽孢杆菌BSD-8（Bacillus sp.BSD-8）,酶纯化后对其性质研究发现,与已报道的SOX相比,该酶的热稳定性更好,这一点对于临床肌酐检测有较高的实际应用价值.因此本研究对该酶进行了深入的研究。此外,发现该菌可以在以肌酐为唯一碳源的条件下生长,推测该菌株很可能还能产生肌酸水解酶、肌酐水解酶。本研究首先对肌氨酸氧化酶基因进行了克隆、表达,采用定向进化技术和建立的高通量筛选方法对肌氨酸氧化酶的热稳定性进行改造;之后对肌酸水解酶基因进行了克隆、表达,酶性质研究;对肌酐水解酶基因进行了克隆、测序。论文的主要研究结果如下:1 Bacillus sp.BSD-8肌氨酸氧化酶基因的克隆、测序与表达:利用染色步移的方法克隆到BSD-8菌株SOX的全序列,该基因的大小为1164 bp,可编码387个氨基酸。与Genbank数据库中单亚基肌氨酸氧化酶的氨基酸序列同源性很高。成功构建了两套表达系统:一高效表达载体pET-15b（－）和BL21（DE3）的表达系统,特点为加入诱导物IPTG时蛋白高效表达,表达蛋白SOX约占细胞总蛋白的30%;二克隆载体pBluscript KS（+）Ⅱ和E.coli DH 5α的表达系统,特点为含蓝白斑筛选标记,阳性克隆子显白斑易于鉴定,不需要加诱导物IPTG酶得到表达,表达量约为上述表达系统的一半,可用于之后的定向进化筛选实验。2肌氨酸氧化酶的纯化与酶性质的研究:大肠杆菌表达的肌氨酸氧化酶经带Ni-IDA柱一步纯化后,得到的纯酶经SDS-PAGE电泳后表现为一条带,分子量为51 KDa,酶的比活为28.6 U/mg。重组SOX与来源于BSD-8的酶性质基本相同。该酶在pH8.5,温度60℃时反应活性最高;其在60℃以下,pH7.0-10.0范围内可稳定存在;以肌氨酸为底物的Km值为3.1mM,其转换常数Kcat为24/s。唯独与黄素的结合方式不同,重组酶是以共价键与黄素结合,而BSD-8的SOX是以非共价键与黄素结合。3热稳定性肌氨酸氧化酶的定向进化:通过易错PCR、定点突变相结合,建立了肌氨酸氧化酶的定向进化策略;微孔板结合表面活性剂破壁的酶活测定方法可以有效的用于耐热肌氨酸氧化酶的筛选;对肌氨酸氧化酶进行定向进化和筛选,获得了热稳定性显著提高的突变体,突变酶soxM2有三个氨基酸被替换,热稳定性比野生酶高5℃（由60℃提高到65℃）。4肌酸水解酶基因的克隆、高效表达及酶性质的研究:利用反向PCR的方法得到BSD-8菌株肌酸水解酶的全序列,该基因的大小为1236 bp,可编码411个氨基酸。成功构建了pET-28a-CRE和BL21（DE3）、pET-28a-CRE和BL21（DE3）pLysS两套表达系统,结果发现在宿主菌BL21（DE3）pLysS表达的重组酶量较在菌株BL21（DE3）的高1.64倍。在宿主菌BL21（DE3）pLysS表达的肌酸水解酶经硫酸铵沉淀、Ni-IDA柱纯化后,得到的纯酶经SDS-PAGE电泳后表现为一条带,分子量为54 KDa,酶比活为79.4U/mg。5肌酐水解酶基因的克隆、测序:利用DNA Walking SpeedUpTMPremix KitⅡ试剂盒克隆到BSD-8菌株肌酐水解酶的全序列,该基因的大小为747 bp,可编码248个氨基酸。与GenBank中的肌酐水解酶基因的氨基酸序列同源性较低。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1 肌酐检测方法
• 1.1 化学方法
• 1.2 酶促方法
• 1.2.1 肌酐转化为甲基乙内酰脲和NH4的酶促方法
• 1.2.2 肌酐转化为肌酸-以NADH为指示剂的酶促方法
• 1.2.3 降解肌酐为肌酸、肌氨酸、甘氨酸的酶促方法
• 1.3 电气化学方法
• 2 肌酐水解酶的研究概况
• 2.1 产肌酐水解酶的微生物
• 2.2 肌酐水解酶的酶学性质
• 2.3 肌酐水解酶的分子生物学研究
• 2.4 肌酐水解酶结构与功能的研究
• 3 肌酸水解酶的研究概况
• 3.1 肌酸水解酶的分布
• 3.2 肌酸水解酶的酶学性质
• 3.3 肌酸水解酶的分子生物学研究现状
• 3.4 肌酸水解酶结构与功能研究
• 4 肌氨酸氧化酶的研究概况
• 4.1 肌氨酸氧化酶的分布
• 4.2 肌氨酸氧化酶的酶学性质
• 4.2.1 单聚体肌氨酸氧化酶
• 4.2.2 多聚体肌氨酸氧化酶
• 4.3 肌氨酸氧化酶的分子生物学研究
• 4.4 肌氨酸氧化酶的结构与功能研究
• 5 蛋白质工程
• 5.1 理性设计
• 5.2 定向进化
• 5.2.1 随机突变
• 5.2.2 重组技术
• 5.2.3 区域性选择突变
• 5.3 突变库的筛选
• 5.3.1 表型观察选择和筛选
• 5.3.2 96孔板筛选
• 5.3.3 噬菌体表面展示技术
• 5.3.4 核糖体展示技术
• 5.3.5 细菌表面展示技术
• 5.4 定向进化应用
• 6 选题背景及研究内容
• 第二章 芽孢杆菌Bacillus sp.BSD-8肌氨酸氧化酶基因的克隆、测序与表达
• 1 材料
• 1.1 菌株、载体和酶
• 1.2 培养基
• 1.3 缓冲液配制
• 1.4 主要仪器和设备
• 2 方法
• 2.1 Bacillus sp.BSD-8肌氨酸氧化酶基因的克隆、测序
• 2.1.1 基因组DNA的提取
• 2.1.2 染色体步移PCR
• 2.1.3 染色体步移PCR具体步骤
• 2.1.4 序列测定与分析
• 2.2 Bacillus sp.BSD-8肌氨酸氧化酶基因的扩增
• 2.3 重组载体的构建
• 2.4 连接产物转化大肠杆菌感受态细胞
• 2.5 转化子的挑选及鉴定
• 2.6 工程菌的诱导表达
• 2.7 肌氨酸氧化酶的测定方法
• 2.8 SDS-PAGE电泳
• 3 结果与分析
• 3.1 Bacillus sp.BSD-8 SOX基因的扩增
• 3.2 重组表达载体的构建
• 3.3 重组载体的表达
• 4 结论
• 第三章 重组肌氨酸氧化酶的纯化及其性质研究
• 1 材料
• 1.1 材料及试剂
• 1.2 培养基及缓冲液
• 1.3 主要仪器
• 2 方法
• 2.1 菌体的大量培养
• 2.2 肌氨酸氧化酶的测定方法
• 2.3 蛋白含量的测定
• 2.4 重组酶的纯化
• 2.5 重组肌氨酸氧化酶性质的研究
• 2.6 SOX与黄素的结合方式的研究
• 3 结果
• 3.1 肌氨酸氧化酶的纯化结果
• 3.2 SOX的最适作用温度与热稳定性
• 3.3 SOX的最适作用pH与pH稳定性
• 3.4 酶促反应动力学研究
• 3.5 SOX与黄素的结合
• 4 讨论
• 5 结论
• 第四章 肌氨酸氧化酶的定向进化
• 1 材料
• 1.1 菌株、载体和酶
• 1.2 主要仪器和设备
• 2.方法
• 2.1 质粒的提取
• 2.2 易错PCR扩增肌氨酸氧化酶基因
• 2.3 突变库的构建
• 2.4 突变文库的筛选
• 2.5 定点突变
• 2.6 构建pET-soxM2和BL21（DE3）表达系统
• 2.7 突变酶的热稳定性
• 3.结果与分析
• 3.1 肌氨酸氧化酶体外定向进化设计
• 3.2 易错PCR建立突变文库
• 3.4 定点突变
• 3.5 构建pET-soxM2表达载体
• 3.6 突变酶soxM2的热稳定性
• 3.7 热稳定性突变酶的耐热机制分析
• 4 讨论
• 5 结论
• 第五章 肌酸水解酶基因的克隆、表达与酶性质研究
• 1 材料
• 1.1 菌种和载体
• 1.2 工具酶及试剂盒
• 1.3 常用仪器
• 2 实验方法
• 2.1 Bacillus sp.BSD-8基因组DNA的提取
• 2.2 Bacillus sp.BSD-8肌酸水解酶基因的克隆和测序
• 2.3 构建重组载体pET-28a-CRE
• 2.4 工程菌的诱导表达
• 2.5 重组酶的纯化
• 2.6 肌酸水解酶的酶活测定
• 3 结果与分析
• 3.1 Bacillus sp.BSD-8 CRE基因的扩增
• 3.2 重组表达载体pET-28a-CRE的构建
• 3.3 重组表达载体pET-28a-CRE的诱导表达
• 3.4 肌酸水解酶的纯化结果
• 4 讨论
• 5 结论
• 第六章 肌酐水解酶基因的克隆、测序
• 1 材料
• 1.1 菌株、载体和酶
• 1.2 常用培养基
• 1.3 主要仪器和设备
• 2 试验方法
• 2.1 基因组DNA的提取
• 2.2 Bacillus sp.BSD-8肌酐水解酶基因片段的扩增
• 2.3 Bacillus sp.BSD-8肌酐水解酶基因侧翼序列的扩增
• 2.4 序列测定与分析
• 3 结果与分析
• 3.1 Bacillus sp.BSD-8肌酐水解酶基因片段的扩增
• 3.2 Bacillus sp.BSD-8肌酐水解酶基因侧翼序列的扩增
• 4 结论
• 第七章 结论与展望
• 1 结论
• 1.1 Bacillus sp.BSD-8肌氨酸氧化酶基因的克隆、测序与表达
• 1.2 肌氨酸氧化酶的纯化与酶性质的研究
• 1.3 热稳定性肌氨酸氧化酶的定向进化
• 1.4 肌酸水解酶基因的克隆、高效表达及酶性质的研究
• 1.5 肌酐水解酶基因的克隆、测序
• 2 展望
• REFERENCES
• 作者简介