对家蚕几丁质酶具强水解活性的弹性蛋白酶Chi-Elastase的分离及其相关分子基础研究

论文摘要

几丁质是真菌细胞壁、细胞隔膜，昆虫外骨骼的主要结构成分。几丁质酶在含几丁质生物的新陈代谢过程中发挥了极为重要的作用。昆虫蜕皮过程中需要几丁质酶部分降解外骨骼中的几丁质；真菌出芽生殖过程中也需要几丁质酶降解子母细胞之间隔膜中的几丁质。故几丁质酶可能成为开发新型药物的特异性作用靶标。几丁质酶抑制物可以通过抑制几丁质酶的活性，阻止昆虫幼虫和蛹蜕皮以及真菌子母细胞的分离而起到杀虫和抗真菌作用。目前，几丁质酶抑制物的相关研究主要在日本等国进行，在国内开发出具有自主知识产权的几丁质酶抑制物具有非常重要的意义。 本研究以家蚕几丁质酶作为靶标，旨在自然环境中筛选分离几丁质酶抑制化合物产生菌；对筛选出的目的菌株进行菌种鉴定、培养条件的优化；在分离纯化活性物质的基础上，进行活性物质编码相关基因的克隆分析和抑制机理的探讨。 1．几丁质酶抑制物产生菌的筛选 本研究首先建立了几丁质酶抑制物简易检测方法——平板透明圈法，此法便于在初筛过程中进行高通量筛选。以此方法从采自全国的200多份土样中分离出的1350多株菌中筛选出五株几丁质酶抑制物产生菌；复筛时使用铁氰化钾方法和3，5-二硝基水杨酸法确定了能稳定生成几丁质酶抑制物的1237#菌株。 1237#菌株活性发酵液对几种酶的抑制谱分析结果显示1237#菌株活性发酵液对链霉菌几丁质酶、沙雷氏菌几丁质酶、假单胞菌几丁质酶及植酸酶、纤维素酶、a-淀粉酶无抑制效果，仅仅对家蚕几丁质酶具有强烈地抑制活性。 2．几丁质酶抑制物产生菌的菌种鉴定 本研究系统地进行了1237#菌株的分类鉴定。研究结果表明，1237#菌株为革兰氏阴性杆状细菌，菌体大小为0.5-0.8μm×1.5-2μm；是无芽孢，具鞭毛，能运动的好氧菌；37℃在马铃薯固体培养基上生长18-24h菌体呈绿色；过氧化氢酶和氧化酶反应均呈阳性；明胶水解反应为阳性；脓青素反应为阴性。最适生长温度为37℃，4℃不生长，41℃能生长。 以1237#菌株基因组为模板，用细菌16S rRNA基因通用引物扩增了1237#菌株16S rRNA基因，扩增片段与pMD-18T载体连接后，转化入大肠杆菌E．coli DH5a感受态细胞，筛选阳性重组质粒进行测序分析。测得片段大小为1606bp，与NCBI核酸库进行比对分析的结果表明其与多种假单胞菌16S rRNA基因（GenBank登录号：AF125317、AB117953、AJ249451）同源性在99％以上。 综合形态学特征、生理生化特性及16S rRNA基因测序分析结果，鉴定几丁质酶抑制物产生菌1237#菌株为假单胞菌，命名为Pseudomonas sp．1237#。 3．几丁质酶抑制活性成分的分离纯化及性质研究

论文目录

• 独创性声明
• 学位论文版权使
• 摘要
• Abstract
• 第1章 文献综述
• 1.1 几丁质的结构及分布
• 1.1.1 几丁质的结构、特征
• 1.1.2 几丁质的分布
• 1.2 几丁质酶的种类、分布及作用
• 1.2.1 几丁质酶的种类
• 1.2.2 几丁质酶的分布
• 1.2.3 几丁质酶在含几丁质生物新陈代谢中所发挥的作用
• 1.3 几丁质酶抑制物的研究现状
• 1.3.1 几丁质酶抑制物来源
• 1.3.2 几丁质酶抑制物的种类及抑制机理
• 1.3.3 几丁质酶抑制物的新功能的开发和研究
• 1.3.4 几丁质酶抑制物应用于生产时存在的问题及应用前景
• 1.4 弹性蛋白酶研究状况
• 1.4.1 弹性蛋白酶的来源
• 1.4.2 弹性蛋白酶的作用
• 1.4.3 弹性蛋白酶作为几丁质酶抑制物所具有的优势
• 1.5 化学农药造成的危害,微生物农药的优势
• 1.5.1 化学农药的危害
• 1.5.2 微生物农药的优势
• 1.5.3 微生物来源几丁质酶抑制物的作为生物农药所具有的优势
• 第2章 引言
• 2.1 研究背景与意义
• 2.1.1 微生物来源几丁质酶抑制物的研究目的和意义
• 2.1.2 几丁质酶抑制物应用于生产实际时所遇到的实际困难与问题
• 2.2 主要研究内容
• 2.2.1 几丁质酶抑制物产生菌的筛选鉴定
• 2.2.2 活性成分的分离纯化
• 2.2.3 目的菌株生产几丁质酶抑制物培养条件的优化
• 2.2.4 几丁质酶抑制物编码相关基因的克隆分析及表达研究
• 2.2.5 抑制机理的初步探索
• 2.3 技术路线
• 2.4 本论文的创新点
• 第3章 几丁质酶抑制物产生菌的分离筛选
• 3.1 材料
• 3.1.1 实验仪器与设备
• 3.1.2 化学试剂
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 土壤样品的采集处理
• 3.2.2 菌种的分离培养
• 3.2.3 胶体几丁质制备方法
• 3.2.4 家蚕几丁质粗酶制备方法
• 3.2.5 几丁质酶活性检测方法
• 3.2.6 几丁质酶抑制物产生菌筛选方法
• 3.2.7 氨基葡萄糖标准曲线的制作
• 3.2.8 几丁质酶抑制活性发酵液抑制酶谱的检测分析
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 初筛试验结果
• 3.3.2 复筛试验结果
• 3.3.3 目的菌株几丁质酶抑制活性发酵液抑制酶谱的研究结果
• 3.4 小结
• 第4章 几丁质酶抑制物产生菌的菌种鉴定
• 4.1 材料
• 4.1.1 实验菌株
• 4.1.2 主要使用仪器
• 4.1.3 试剂
• 4.1.4 主要使用培养基
• 4.2 方法
• 4.2.1 经典鉴定方法
• 4.2.2 16S rRNA基因分析
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 菌株形态学特征
• 4.3.2 菌株生理生化特征
• #菌株16S rRNA基因扩增、测序分析'>4.3.3 1237^#菌株16S rRNA基因扩增、测序分析
• 4.4 小结
• 第5章 几丁质酶抑制活性成分的分离纯化及性质研究
• 5.1 材料
• 5.1.1 供试菌种
• 5.1.2 实验仪器设备
• 5.1.3 试剂
• 5.1.4 培养基
• 5.2 方法
• 5.2.1 几丁质酶抑制活性的检测与计算方法
• 5.2.2 活性发酵液的制备方法
• 5.2.3 活性发酵液中几丁质酶抑制活性成分理化性质的初步探索
• 5.2.4 几丁质酶抑制活性成分的分离纯化
• 5.2.5 弹性蛋白酶活检测方法
• 5.2.6 猪胰腺弹性蛋白酶对家蚕几丁质酶活性的影响
• 5.2.7 活性物质纯品对家蚕生长的影响
• 5.2.8 活性物质纯品与几丁质酶作用前后的碱性Native-PAGE和SDS-PAGE电泳
• 5.2.9 Native-PAGE的考马斯亮兰染色
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 几丁质酶抑制活性成分理化性质初探结果
• 5.3.2 活性物质的分离纯化
• 5.3.3 纯化活性样品的电泳转膜、N-端10个氨基酸测序
• 5.3.4 弹性蛋白酶活性检测结果
• 5.3.5 猪胰腺弹性蛋白酶对家蚕几丁质酶的作用
• 5.3.6 Chi-Elastase对家蚕生长的影响
• 5.3.7 Chi-Elastase与几丁质酶作用前后的SDS-PAGE及Native-PAGE结果
• 5.4 小结
• 第6章 Chi-Elastase生产条件的优化
• 6.1 材料
• 6.1.1 供试菌株
• 6.1.2 主要药品和试剂
• 6.1.3 培养基
• 6.2 方法
• 6.2.1 菌种培养方法
• 6.2.2 几丁质酶抑制物活性检测方法
• #菌株生长曲线的绘制'>6.2.3 Pseudomonas.sp 1237^#菌株生长曲线的绘制
• 6.2.4 单因素实验设计
• 6.2.5 正交实验方法
• 6.3 结果与分析
• #菌株生长曲线'>6.3.1 Pseudomonas sp.1237^#菌株生长曲线
• 6.3.2 单因素选择结果
• 6.3.3 正交实验结果及回归分析
• 6.4 小结
• 第7章 Chi-Elastase编码基因的克隆分析及表达研究
• 7.1 材料
• 7.1.1 供试菌种与设备
• 7.1.2 试剂及培养基
• 7.2 方法
• 7.2.1 Chi-Elastase N-端10个氨基酸序列分析研究
• 7.2.2 Chi-Elastase前体蛋白编码基因的克隆分析
• 7.2.3 Chi-Elastase成熟蛋白编码序列的表达研究
• 7.2.4 表达产物的活性检测
• 7.3 结果与分析
• 7.3.1 Chi-Elastase N-端10个氨基酸序列比对分析结果
• 7.3.2 Chi-Elastase前体蛋白编码基因克隆研究结果
• 7.3.3 Chi-Elastase成熟蛋白编码序列的表达研究结果
• 7.3.4 表达产物的活性检测
• 7.4 小结
• 第8章 Chi-Elastase特异性水解家蚕几丁质酶机理的初探
• 8.1 假单胞菌弹性蛋白酶序列分析及作用特性
• 8.1.1 假单胞菌弹性蛋白酶二级结构分析
• 8.1.2 假单胞菌弹性蛋白酶三级结构分析
• 8.2 家蚕几丁质酶与其它3种酶序列的比较分析
• 8.2.1 几种酶氨基酸序列的选取
• 8.2.2 几种酶氨基酸序列的比对分析
• 8.2.3 四种几丁质酶二级结构分析比较
• 8.2.4 四种几丁质酶三级结构分析比较
• 8.3 结论
• 第9章 主要研究结论
• 参考文献
• 攻读博士学位期间发表论文及参研课题情况
• 致谢