FOXO1在非霍奇金淋巴瘤细胞凋亡中作用的研究

论文摘要

背景和目的:转录因子叉头框蛋白O1（Forkhead box O1,FOXO1）是一类分布广泛,作用多样的转录因子,与细胞的分化、凋亡、DNA修复等有密切的关系。近年来的研究发现,FOXO1的失活与人类多种肿瘤的发生、发展及预后密切相关,提示FOXO1是一个肿瘤抑制因子。因此重新激活FOXO1以促进肿瘤细胞的凋亡已成为肿瘤研究的热点之一,是一个有待拓展并具有重要意义的研究方向。PI3K/Akt通路在调节FOXO1活性中起着关键性的作用,激活的PI3K/Akt通路磷酸化FOXO1蛋白,使其滞留于细胞质中丧失其转录活性。抑制PI3K/Akt通路可通过去磷酸化激活FOXO1,发挥抑制增殖和促凋亡作用。因此通过药物干预PI3K/Akt通路的活性,可以抑制FOXO1的磷酸化,重新激活FOXO1,促进肿瘤细胞的凋亡。Wortmannin是PI3K激酶的强效抑制剂,可与PI3K激酶不可逆结合,在一定浓度范围内选择性抑制PI3K,使PI3K/Akt通路失活。Wortmannin可以诱导肿瘤细胞的增殖抑制和凋亡,并对化疗药物诱导的凋亡有增效作用。而足叶乙甙是常用的非霍奇金淋巴瘤化疗药物,是细胞实验最常用的凋亡诱导药物,近年来研究显示足叶乙甙亦可参与影响PI3K/Akt信号通路,因此PI3K抑制剂wortmannin可能影响足叶乙甙对细胞增殖和凋亡的作用。体外研究证实,在前列腺癌、乳腺癌、肠癌等多种肿瘤细胞中抑制FOXO1的磷酸化抑制肿瘤细胞增殖,促进肿瘤细胞凋亡。但FOXO1在淋巴瘤细胞增值和凋亡中的意义尚未明确。本实验的目的在于研究FOXO1蛋白的磷酸化与淋巴瘤细胞增殖和凋亡的关系,并进一步探讨FOXO1蛋白在淋巴瘤细胞凋亡中的具体作用机制。方法:1.XTT检测wortmannin作用下以及wortmannin联合足叶乙甙作用下淋巴瘤细胞Jurkat和Namalwa的生长抑制率。2.流式细胞仪检测wortmannin作用下以及wortmannin联合足叶乙甙作用下淋巴瘤细胞Jurkat和Namalwa的凋亡率。3.提取总蛋白,Western blot法检测wortmannin作用下以及wortmannin联合足叶乙甙作用下淋巴瘤细胞Jurkat和Namalwa中蛋白p-Akt,p-FOXO1,FOXO1,Bim量的变化。结果:1.淋巴瘤细胞生长抑制情况:Wortmannin单药:wortmannin抑制Jurkat细胞和Namalwa细胞生长,具有时间、浓度依赖性。0.1、0.25、0.5、1μmol/L wortmannin处理Jurkat细胞24小时后抑制率分别为（9.49±0.72）%、（13.38±1.60）%、（16.52±1.79）%、（21.05±1.96）%,和对照组相比抑制率差异有显著的统计学意义（p＜0.01）,进一步方差分析显示各组间差别有显著的统计学意义（p＜0.05）。同一浓度24小时和48小时的抑制率相比较,p值分别为0.015、0.004、0.002、0.003,差异有统计学意义。Wortmannin联合足叶乙甙:单用5μmol/L足叶乙甙作用淋巴瘤细胞Jurkat和Namalwa 24小时后抑制率分别为（34.13±3.27）%和（21.93±2.50）%,0.5μmol/Lwortmannin预处理细胞后联合足叶乙甙,抑制率增加为（54.19±4.16）%和（42.63±3.47）%,联合应用wortmannin可明显增强足叶乙甙对淋巴瘤细胞的抑制,差异有统计学意义(pjurkat=O.003,pnamalwa=0.001)。2.淋巴瘤细胞凋亡率:Annexin V+PI检测结果提示wortmannin诱导了淋巴瘤细胞Jurkat和Namalwa时间依赖性的凋亡。0.5μmol/LWortmannin作用24小时和48小时,Jurkat细胞的凋亡率分别为（13.28±1.53）%和（17.17±1.58）%,Namalwa细胞的凋亡率分别为（9.84±1.30）%和（14.65±1.43）%。24小时和48小时的细胞凋亡率之间差异有统计学意义(pjurkat=0.038,pnamalwa=0.013),与对照组相比较,差异有显著的统计学意义（p＜0.01）。Wortmannin与足叶乙甙联合作用于淋巴瘤细胞诱导的凋亡率高于wortmannin和足叶乙甙单药,差异有显著统计学意义（p＜0.01）。3.wortmannin和足叶乙甙作用下淋巴瘤细胞p-Akt、p-FOXO1、FOXO1、Bim蛋白水平的变化。wortmannin作用3小时后,Jurkat细胞中p-Akt、p-FOXO1明显减少,同时细胞内的FOXO1、Bim蛋白增加,p-FOXO1、FOXO1、Bim的变化随时间的延长更加明显。Namalwa细胞中蛋白含量变化趋势与Jurkat细胞基本一致,但p-Akt、p-FOXO1的抑制程度较弱。足叶乙甙处理淋巴瘤细胞后,上调细胞中的p-FOXO1水平,经wortmannin联合作用后其p-FOXO1水平明显下降,Bim蛋白表达明显升高。结论:1.在非霍奇金淋巴瘤细胞中,FOXO1的磷酸化水平与细胞凋亡率呈负相关。2.抑制PI3K/Akt通路活性可能通过抑制FOXO1磷酸化,上调Bim蛋白的表达,促进细胞凋亡。3.足叶乙甙可使FOXO1的磷酸化水平升高。wortmannin通过抑制FOXO1磷酸化,增强足叶乙甙对淋巴瘤细胞凋亡的诱导作用。

论文目录

• 英文缩写索引
• 中文摘要
• 英文摘要
• 1.前言
• 2.材料与方法
• 3.结果
• 4.讨论
• 5.结论
• 6.参考文献
• 综述
• 致谢
• 附录 在校期间发表论文