论文题目: SARS-CoV N蛋白功能的分子机制和作为抗原在SARS诊断上的应用
论文类型: 博士论文
论文专业: 生物化学与分子生物学
作者: 特马力
导师: 叶林柏
关键词: 非典型性肺炎,非典型性肺炎诊断,核衣壳蛋白,蛋白质纯化,免疫荧光,核定位,核仁定位信号,细胞周期,活性
文献来源: 武汉大学
发表年度: 2005
论文摘要: PhD candidate: Khalid Amine Timani ID No. 2001193004 Academic Supervisor: ProfLinbai Ye Sate Key lab of Virology, College of Life Sciences, Wuhan University 2003年,非典型性肺炎在全世界30多个国家广泛流行,给人类健康带来了极大的威胁和伤害。2003年4月16日,WHO正式确定非典型性肺炎的病原体是冠状病毒家族中的一个变种,将此病毒正式命名为“SARS病毒”。虽然目前没有新的SARS疫情发生,但是SARS仍然对全人类的健康存在着威胁。因此,对SARS病毒的实验研究将有助于了解SARS疾病的传播以及感染机制和控制SARS疾病。 武汉大学生命科学学院从湖北SARS病人血清中分离到了SARS冠状病毒湖北株SARS-CoV(Hubei)。我们对该毒株的核衣壳蛋白(Nucleocapsid protein,N protein)的基因序列进行了测序(序列已提交至基因库Genbank,序号为AY365036),并使用DNAStar软件对SARS-CoV(Hubei)的N蛋白的基因序列同在中国北京、广东、浙江、香港和台湾分离出的其他11株SARS病毒的N蛋白的基因序列,以及加拿大、新加坡、意大利、德国和美国的SARS病毒的N蛋白的基因序列进行了对比。序列对比的结果表明,N蛋白基因序列上出现了两处碱基替代,分别是第284个核苷酸由T变为C和第689个核苷酸由A变为G。这两处的碱基替代都是错义突变,均导致了蛋白质氨基酸序列的改变,即在N蛋白的氨基酸序列上的第95个氨基酸由缬氨酸突变为丙氨酸,第230个氨基酸由精氨酸突变为谷氨酸。 由于非典型性肺炎有极高的传染性,因此发展在SARS冠状病毒感染早期的诊断技术是当务之急。我们应用PCR技术从已有的pGEMT-N质粒中扩增获得长度约为1.2kb的N基因序列,并将此DNA序列克隆到原核表达载体pET-His中,将重组质粒pET-His-N转化大肠杆菌BL21(DE3)后,IPTG诱导使其在大肠杆菌中表达,收集菌体,超声波振荡裂解菌体,用Ni-NTA-Superflow亲和层析柱从裂解液中纯化N蛋白,SDS-PAGE检测N蛋白纯化情况。我们用纯化的重组N蛋白作为抗原,用ELISA检测16份已确诊的非典型性肺炎病人阳性血清和131份正常人阴性血清的SARS冠状病毒特异性IgG抗体。发病10天的SARS病人血清的阳性检出率是81.3%(13/16),发病20天的SARS病人血清的阳性检出率是100%(16/16),发病30天的SARS病人血清的阳性检出率是100%(16/16),阴性血
论文目录:
Abstract
摘要
Table of Contents
1 Introduction
1.1 SARS epidemiology and etiology
1.2 Origin of SARS virus
1.3 SARS-CoV genome structure
1.4 SARS-CoV structural proteins
1.5 SARS-CoV nucleocapsid protein
1.6 The first research objective: SARS-CoV N protein used for serodiagnosis
1.7 The second research objective: sub-cellular localization properties of SARS-CoVN protein
1.8 The third research objective: investigate the possible role of N protein in signal transduction pathway
2 Materials and method
2.1 Clinical Samples
2.2 Cells culture
2.3 Virus infection and isolation of viral RNA
2.4 Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR)
2.5 Sequence analysis of SARS-CoV N protein gene
2.6 Plasmids construction
2.7 Prokaryotic expression and purification of SARS-CoV N protein
2.8 Preparing microplates for Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
2.9 Generation of anti-N polyclonal antibody in rabbit
2.10 Cell transfection
2.11 Establishments of stable nucleocapsid protein-expressing Vero E6 cell line
2.12 Western blotting
2.13 Indirect immunofiuorescence assay and confocal microscopy
2.14 LeptomycinB treatment
2.15 Flow cytometry and colony formation efficiency assays
2.16 Luciferase assay
3 Results
3.1 SARS-CoV nucleocapsid protein gene sequence analysis
3.2 Expression and characterization of SARS-CoV recombinant nucleocapsid protein
3.3 Detection of IgG antibodies against N protein in the sera of SARS patients
3.4 Production and characterization of rabbit anti-nucleocapsid polyclonal antibodies
3.5 Intracellular localization of SARS-CoV N protein in infected and transfected cell lines
3.6 Subcellular localization of N protein alters upon N- and/or C-terminal deletion mutations
3.7 Expression and intracellular localization of N-GFP fusion proteins
3.8 The leucine rich region may act as nuclear export signal
3.9 Stable cell line constitutively expressing N protein affects cell cycle profile
3.10 SARS-CoV N protein can activates NF-kB in dose-dependent manner
3.11 The conformation of SARS-CoV N protein is important for its NF-kB activation
4 Discussion
5 References
6 Acknowledgments
7 List of Figures
8 List of Tables
9 Publications
发布时间: 2006-03-27
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