悬钩子属植物遗传多样性及其特异资源的筛选

论文摘要

悬钩子属Rubus L.,又名树莓属,是蔷薇科Rosaceae中的一个大属。全世界有悬钩子属植物750-1000种,中国有200多种,其中有130多种是特有种。该属植物中果实可食的用于园艺栽培生产的种类称为树莓或可食悬钩子,其果实具有较高的营养价值和医疗保健作用,美国人称之为“生命之果”,世界粮农组织（FAO）将其推荐为“世界第三代水果”,在世界范围内得到了广泛种植,已成为继草莓、越桔和醋栗之后发展最快的小果类果树。发展树莓生产,品种是关键。然而,没有优良的种质就不可能有优良的新品种,而了解物种的遗传基础以及物种之间的亲缘关系是合理有效利用种质资源的基础和前提。目前,我国育成的树莓品种极少,而同时我国西南地区是悬钩子属植物的分布和分化中心,类型复杂,变异性大,但对其研究主要以形态描述为主,内在系统学研究较少,遗传基础和遗传关系知之甚少,许多种的分类尚存争议。因此,本研究首次系统地对西南地区尤其是四川分布的悬钩子属Rubus植物中树莓优良野生种质分布集中的空心莓组Sect.Idaeobatus和木莓组Sect.Malachobatus的14个亚组的30多个种类以及国外引进的树莓品种进行细胞学、孢粉学和分子生物学研究,探讨种类品种亲缘关系和遗传差异,并对在种质资源调查过程中发现的树莓优良野生种质和18个引进树莓品种进行筛选和评价,以期为该属植物的系统演化规律和合理分类提供依据,为树莓育种种质的有效选择奠定基础。其主要结果如下:1以红泡刺藤R.niveus、栽秧泡R.ellipticus var.obcordatus和插田泡R.coreanus绿枝或硬枝扦插生根的根尖为材料,通过取材时季与扦插环境气温,8-羟基喹啉、秋水仙素和对二氯苯3种药剂在不同的温度下预处理不同时间,混合酶液和盐酸在不同温度下解离,醋酸洋红、卡宝品红、席夫试剂和铁矾-苏木精各染色剂染色压片等的对比研究,并以细胞中有丝分裂中期分裂相的数目、染色体的清晰性、分散程度和聚缩程度以及染色体的形态为衡量指标,探索出适于悬钩子属植物核型分析的根尖压片方法是:当根尖长至1-2cm、扦插环境气温17-23℃时取材,卡诺氏固定液Ⅰ低温固定24h,用0.002mol·L-18-羟基喹啉在0-4℃下预处理24h,再用1mol·L-1HCl 60±1℃恒温解离4-7min,最后用卡宝品红染色压片能获得效果好染色体标本,该染色体标本完全适用于核型分析。2采用根尖压片法对中国悬钩子属Rubus空心莓组Sect.Idaeobatus和木莓组Sect.Malachobatus 13个亚组的32个种（变种）45个居群以及15个国外引进的树莓栽培品种进行了细胞学研究。研究结果表明:（1）研究的所有材料的间期核和前期核都分别属于球状前染色体型（Round prochromosome type）和近基型（Proximal type）:（2）所有材料均为整倍体,有未发现有非整倍体类型;（3）中国空心莓组Sect.Idaeobatus和木莓组Sect.Malachobatus植物染色体均小形,绝对长度均在3μm以下,染色体由中部着丝点染色体（约90%）和近中部着丝点染色体构成,核型分类主要属于“1A”型（85%以上）,说明这两组植物在整个系统演化中处于相对原始的地位。但是两个组的染色体数目和核型结构有较大差异。在空心莓组Sect.Idaeobatus的21种（变种）植物中,除拟复盆子R.idaeopsis为2n=3x=21、茅莓R.parvifolius存在2n=2x=14、2n=3x=21、2n=4x=28和2n=2x=14与2n=4x=28的混倍体等4种倍性类型外,其余种（变种）染色体数目均为2n=2x=14。而在木莓组Sect.Malachobatus的11个种（变种）中,除寒莓R.buergeri为2n=8x=56外,其余种的染色体数目和倍性均为2n=4x=28。此外,本研究所涉及的空心莓组Sect.Idaeobatus 11个亚组中的7个亚组的21个种（变种）,亚组内的物种间甚至同一物种的不同居群间染色体核型构成差异明显,有些甚至超过了亚组间一些物种的差异;而涉及的木莓组Sect.Malachobatus 13个亚组的6个亚组11个种（变种）,亚组间物种染色体核型结构差异较明显,但亚组内物种间染色体核型结构差异较小,依据细胞学资料对其系统演化和一些种的分类进行了讨论;（4）对从国外引进的8个树莓种群品种和7个黑莓种群品种的核型研究表明,它们都为整倍体,未见非整倍体。8个树莓种群的品种染色体数目均为14条,而7个黑莓种群品种有28、42和49三种不同的染色体数目。在树莓种群的8个品种中,‘Algonquin’、‘Reveille’、‘Ploana’和‘Dinkum’4个品种的核型公式皆为2n=2x=14=14m,‘Chilcotin’、‘Nova’和‘Bristol’3个品种核型公式为2n=2x=14=14m（2SAT）,‘Chilliwack’的核型公式为2n=2x=14=14m（4SAT）。而黑莓种群的7个品种的核型公式分别如下:‘Arapaho’、‘Shawnee’和‘Navaho’为2n=4x=28=28m,‘Ollalie’为2n=6x=42=38m（6SAT）+4sm,而‘Black Butte’、‘Boysen’和‘Kotata’为2n=7x=49=49m。在核型分类上,除‘Ollalie’由中部着丝粒和近中部着丝粒染色体构成属于“2A”型核型外,其余的14个品种均由中部着丝粒染色体构成,为“1A”型核型。上述研究中拟复盆子R.idaeopsis（2n=3x=21）、紫红悬钩子R.subinopertus（2n=2x=14）、栽秧泡R.ellipticus var.obcordatus（2n=2x=14）、密刺悬钩子R.subtibetanus（2n=2x=14）、刺萼红花悬钩子R.inopertus var.echinocalyx（2n=2x=14）、秀丽莓R.amabilis（2n=2x=14）、直立悬钩子R.stans（2n=2x=14）、光滑悬钩子R.tsangii（2n=2x=14）、乌泡子R.parkeri（2n=4x=28）、峨嵋悬钩子R.faberi（2n=4x=28）和奕武悬钩子R.yiwuanus（2n=4x=28）等11个种（变种）和‘Algonquin’、‘Chilcotin’、‘Reveille’、‘Chilliwack’、‘Nova’、‘Ploana’、‘Dinkum’、‘Bristol’和‘Black Butte’9个树莓品种的染色体数目、30个悬钩子属植物种（变种）和15个树莓品种的核型以及该属植物存在混倍体类型（茅莓R.parvifolius（2n=2x=14与2n=4x=28的混倍体））为首次报道。3用扫描电镜对中国悬钩子属Rubus空心莓组Sect.Idaeobatus和木莓组Sect.Malachobatus 9亚组16种（变种）的20个居群以及从国外引进的分属于黑莓种群和树莓种群的17个栽培品种共37份材料的花粉形态进行了较系统观察和比较分析。结果表明:（1）所有材料的花粉均为长球形或超长球形（P/E为1.67～2.26）,大小多为25.52μm×15.35μm～50.06μm×25.65μm;（2）所观察材料花粉的外壁纹饰在组内和栽培种群内有一定的相似性,但变异丰富,在不同种之间、甚至在同一种群的不同品种和同一种的不同居群之间区别明显。其外壁纹饰共有属于脑纹-穿孔型、穿孔网型和条纹型三大类型的脑纹-穿孔状、穿孔状、网状、穿孔-网状、条纹状、条纹-穿孔状和条纹网状7个亚型;（3）对四川有育种潜力的分属于空心莓组Sect.Idaeobatus和木莓组Sect.Malachobatus的8个树莓优良野生种质与国外引进的17个树莓品种进行了比较分析发现,空心莓组Sect.Idaeobatus的5个种质和树莓种群的品种的外壁纹饰以条纹-穿孔状为主,黑莓种群的品种主为条纹状和条纹-穿孔状,与木莓组Sect.Malachobatus的3个种的差异较大,聚类分析表明树莓种群品种与空心莓组Sect.Idaeobatus的插田泡和茅莓的亲缘关系较近;而黑莓种群与木莓组Sect.Malachobatus的3个有果用育种潜力的任一种质的亲缘关系较远:（4）绒毛叶亚组Subsect.Stimulantes的椭圆悬钩子R.ellipticus和柔毛叶亚组Subsect.Pungentes的红毛悬钩子R.pinfaensis在花粉形态特征上极为相似,实验结果支持两者归并。4对中国悬钩子属Rubus空心莓组Sect.Idaeobatus和木莓组Sect.Malachobatus14个亚组的36个种（变种）的41个居群以及17个引进树莓品种进行了RAPD分析。结果表明:（1）41份野生种质物种间具有丰富的RAPD变异。从85条引物中筛选出的24条引物产生了636条DNA扩增片断,其中608条（95.6%）具有多态性,每个引物可扩增出14-41条多态性带,平均25.3条。RAPD标记的遗传相似系数（GS）变化范围为0.842-0.976。聚类分析显示RAPD标记能将41份悬钩子属材料完全分开,除秀丽莓R.amabilis外,物种间的聚类关系与植物学分类完全一致。因此,RAPD分析方法可为悬钩子属植物的分类鉴定和系统演化提供依据。（2）用RAPD标记对11个中国树莓优良野生种质和17个国外引进栽培品种共28份材料进行亲缘关系研究表明,RAPD标记能将28份材料完全分开,从85条引物中筛选出的22条引物产生了500条DNA扩增片断,其中490条（98.0%）具有多态性,每个引物可扩增出12-33条多态性带,平均22.3条。RAPD标记的遗传相似系数（GS）变化范围为0.687-0.954。聚类能很好地反映这材料种属的亲缘关系以及两大栽培种群的划分,但不能区分树莓种群品种中的红树莓和双季红树莓。（3）11个中国树莓优良野生种质与国外引进的两大树莓种群栽培品种的亲缘关系较远,而两大栽培种群的各自的品种之间亲缘关系较近的事实说明引进的18个品种的遗传基础较为狭窄。（4）支持栽秧泡R.ellipticus var.obcordatus作为独立的种以及椭圆悬钩子R.ellipticus和红毛悬钩子R.pinfaensis归并,保留椭圆悬钩子的种名,但不支持将归并后的椭圆悬钩子划归柔毛叶亚组Subsect.Pungentes,而应该在原所属的绒毛叶亚组Subsect.Stimulantes中。（5）据其不同形态变异的4个不同倍性的茅莓材料的遗传相似系数和亲缘关系,认为三倍体的茅莓R.parvifolius很可能由同一分布地的二倍体茅莓的减数配子（x）和未减数配子（2x）受精融合产生。5通过连续三年对引入四川雅安和西充的11个国外树莓种群品种‘Bristol’、‘Reveille’、‘Killarney’、‘Algonquin’、‘Tulameen’、‘Chilcotin’、‘Chilliwack’、‘Nova’、‘Dinkum’、‘Ploana’和‘Kiwigold’和7个国外黑莓种群品种‘Ollalie’、‘Shawnee’、‘Arapaho’、‘Navaho’、‘Boysen’、‘Black Butte’和‘Kotata’的栽培生物学特性、生长结果习性和果实的内外品质进行较系统的观测以及在对四川雅安、峨眉山、天全、西昌、康定、西充、苍溪、内江等地广泛分布的树莓野生种质进行调查的基础上,从中筛选出了红泡刺藤R.niveus、栽秧泡R.ellipticus var.obcordatus、茅莓R.parvifolius、插田泡R.coreanus、山莓R.corchorifolius、光滑高粱泡R.lambertianus var.glaber和川莓R.setchuenensis 7个有育种潜力的优良种质,对它们进行较全面的观测并与优良栽培品种进行比较评价。结果表明:（1）18个树莓品种与引种地（北京）相比,皆早萌芽,晚落叶,个别黑莓品种甚至不落叶,生育期延长近一个月:虽然平均单果重小,抗逆能力较差,但果实品质好。黑莓在引种地的适应性表现较树莓种群品种好,但个别品种产量不高。综合比较,双季红树莓‘Dinkum’和无刺黑莓‘Arapaho’在四川表现较好,红树莓品种‘Chilcotin’、‘Killarney’和黑莓品种‘Shawnee’和‘Black Butte’次之,其余品种表现较差。（2）7个优良树莓野生种质各有优缺点。川莓R.setchuenensis的突出性状是无刺;山莓R.corchorifolius果实品质优良,但丰产性差;果实品质优良同时丰产性好的种质是插田泡R.coreanus和栽秧泡R.ellipticus var.obcordatus,但其受种质遗传多样性及所处生境的影响较大;光滑高粱泡R.lambertianus var.glaber果实品质偏酸,但Vc含量高;红泡刺藤R.niveus可溶固形物含量高,达到14%,丰产性也好,但出汁率低,种子数量极多;而茅莓R.parvifolius果实品质较好,但种子较大。与引入四川的栽培品种相比,这7个种质除平均单果重偏轻外,其它性状如果实风味、丰产性和适应性,均优于我们引进的树莓种群品种。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 文献综述
• 引言
• 1 悬钩子属植物种质资源
• 1.1 悬钩子属的分类
• 1.2 中国悬钩子属的分类和地理分布
• 1.2.1 中国悬钩子属植物的分类
• 1.2.2 中国悬钩子属植物地理分布
• 1.3 悬钩子属植物栽培种群分类
• 1.4 悬钩子属植物遗传多样性研究
• 2 悬钩子属植物资源利用与品种选育
• 2.1 国外悬钩子属植物种质资源利用与育种
• 2.2 中国树莓优良野生种质的筛选、树莓引种与品种选育
• 3 研究的目的与意义
• 第二章 根尖压片法制备悬钩子属植物的染色体标本
• 引言
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 取材时季
• 1.2.2 预处理
• 1.2.3 解离方法
• 1.2.4 染色剂和染色方法
• 1.3 观察与统计
• 2 结果与分析
• 2.1 取材时间对悬钩子属植物染色体标本制备效果的影响
• 2.2 预处理对悬钩子属植物染色体标本制备效果的影响
• 2.3 解离方法对悬钩子属植物染色体标本制备效果的影响
• 2.4 染色剂对悬钩子属植物染色体标本制备效果的影响
• 3 讨论
• 3.1 取材时间对悬钩子属植物染色体标本制备效果的影响
• 3.2 预处理对悬钩子属植物染色体标本制备效果的影响
• 第三章 悬钩子属植物的细胞学研究
• 引言
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 野生种质
• 1.1.2 栽培品种
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 有丝分裂间期和前期核形态
• 2.2 野生种质的染色体数目、倍性和核型
• 2.2.1 野生种质的染色体数目和倍性
• 2.2.2 野生种质的染色体核型
• 2.3 树莓栽培品种的染色体数目、倍性和核型
• 2.3.1 栽培品种的染色体数目和倍性
• 2.3.2 栽培品种的染色体核型
• 3 讨论
• 3.1 悬钩子属植物倍性变异与系统发育
• 3.2 悬钩子属植物种类核型多样性与系统发育
• 3.3 栽秧泡的分类处理
• 3.4 栽培品种的染色体数目和核型差异与亲缘关系
• 第四章 悬钩子属植物的花粉亚显微形态观察
• 引言
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 野生种质
• 1.1.2 栽培品种
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 悬钩子属植物的花粉亚显微形态
• 2.1.1 花粉的形态特征
• 2.1.2 花粉大小
• 2.1.3 花粉的萌发沟和极面特征
• 2.1.4 花粉的外壁纹饰
• 2.2 引进品种与优良野生种质的花粉形态对比分析
• 3 讨论
• 3.1 悬钩子属植物的花粉形态比较
• 3.2 椭圆悬钩子和红毛悬钩子的分类处理
• 3.3 野生优良种质与栽培品种的关系
• 第五章 悬钩子属植物的RAPD研究
• 引言
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 野生种质
• 1.1.2 树莓栽培品种和优良野生种质
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 总DNA的提取及DNA浓度和质量检测
• 1.2.2 RAPD反应和扩增产物检测
• 1.2.3 材料的聚类和RAPD数据统计分析
• 2 结果与分析
• 2.1 RAPD多态性分析
• 2.2 中国悬钩子属植物的RAPD分析
• 2.2.1 遗传相似系数和聚类分析
• 2.2.2 种间和种内关系
• 2.3 栽培品种与野生优良种质的RAPD分析
• 2.3.1 遗传相似系数和聚类分析
• 2.3.2 种间和品种间关系
• 3 讨论
• 3.1 RAPD标记适合悬钩子植物的分类鉴定和亲缘关系研究
• 3.2 栽秧泡、椭圆悬钩子和红毛悬钩子的分类处理
• 3.3 三倍体茅莓的可能起源
• 3.4 中国树莓野生优良种质与国外引进品种的亲缘关系
• 第六章 树莓特异资源的筛选与评价
• 引言
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 栽培品种
• 1.1.2 野生种质
• 1.2 评价项目和标准
• 1.2.1 主要观测项目
• 1.2.2 取样和观测标准
• 2 结果与分析
• 2.1 树莓的引种评价
• 2.1.1 物候期的观测
• 2.1.2 适应性和抗病性调查和评价
• 2.1.3 果实品质分析和评价
• 2.1.4 丰产性调查和评价
• 2.1.5 引进树莓品种的综合评价
• 2.2 树莓优良野生种质的调查与评价
• 2.2.1 优良野生种质主要植物学性状和分布
• 2.2.2 优良野生种质的适应性和抗逆性评价
• 2.2.3 优良野生种质果实品质分析与评价
• 2.2.4 优良野生种质的丰产性调查与评价
• 2.3 树莓优良野生种质与栽培品种主要经济性状比较
• 3 讨论
• 3.1 引进树莓品种的综合评价
• 3.2 树莓野生种质的评价
• 结论与创新点
• 参考文献
• 致谢
• 博士在读期间发表论文目录