鸡传染性法氏囊病病毒VP1蛋白影响病毒复制及致病性机制的研究

论文摘要

鸡传染性法氏囊病（IBD）是一种危害养禽业的急性、高度接触性传染病。鸡传染性法氏囊病的病原为鸡传染性法氏囊病病毒（IBDV）,属于双RNA病毒科禽双RNA病毒属的成员。IBDV主要侵害3到6周龄雏鸡,破坏中枢免疫系统法氏囊中的B淋巴细胞,导致免疫抑制。IBDV基因组由A和B两条双链组成。其中A节段含有两个开放阅读框,编码VP2、VP3、VP4和VP5蛋白。B节段含有一个开放阅读框,编码VP1蛋白,具有RNA依赖的RNA聚合酶活性。反向遗传技术的成功建立很大程度上推进了IBDV的基础研究工作。众多学者对于IBDV的A节段做了相关的研究,发现IBDV的VP2蛋白对病毒的毒力、细胞嗜性有重要作用,VP3和VP5蛋白也对病毒的复制有一定影响。但是,病毒的毒力是由多个因素共同决定的,VP1对于病毒的复制和毒力也有影响。目前,关于VP1的研究仍相对滞后,VP1对病毒复制及毒力的影响尚未见比较深入的报道。本研究旨在研究VP1与IBDV复制及毒力的关系,并研究其影响病毒复制和毒力的分子机制。本研究首先测定并分析了七株IBDV的B节段全基因组序列,并将全基因组序列上传到GenBank中。通过遗传进化分析结合致病性实验,所测定的七株病毒均属于IBDV超强毒株。根据B节段进化分析,可将B节段划分为三个群,本研究测定毒株的B节段属于第Ⅱ群和第Ⅲ群。通过序列比对,强毒在VP1蛋白上有八个保守的氨基酸位点,分别是4V、61I、145T、287A、508K、511S、646S以及687P。在B节段的5’UTR部分,55T和63A在强毒中是保守的,在3’UTR部分,2786C是保守的。为进一步研究VP1上的保守位点对于病毒的生物学特性是否有影响,本研究根据VP1的三维结构,构建4、61和145位点突变的N端结构域突变株,287、508、511和646位点突变的中心活性结构域突变株和C端结构域的687突变株。首先以弱毒Gt的A节段和超强毒HLJ-4的B节段为骨架构建5株针对B节段不同突变的病毒,研究其在CEF细胞上的复制动力学特性,发现将强毒HLJ-4的B节段上的4、61和145位点突变为弱毒的相应位点,可使病毒在CEF细胞上的复制能力增强。将强毒HLJ-4的B节段上的687位点P突变为弱毒的相应位点S,也可使病毒在CEF细胞上的复制能力增强。进一步拯救出4、61、145单位点突变的病毒,研究其在CEF细胞上的复制动力学特性,发现将强毒的HLJ-4的B节段上的4位点V突变为弱毒的相应位点I,也可使病毒在CEF细胞上的复制能力增强。可见V4I以及P687S突变可提高病毒在CEF细胞的复制能力。为研究影响体外复制的位点是不是会进一步对病毒的毒力造成影响,本研究首先构建了IBDV超强毒株的反向遗传系统。以HLJ-4的A节段和HLJ-4的B节段为骨架拯救出IBDV超强毒亲本毒株。首先将A、B节段的质粒在DF1细胞上转染,转染48 h后,将转染的细胞液反复冻融3次,从尾根部接种3周龄SPF鸡的法氏囊,在接种后3天,拯救各组不同病毒的SPF鸡均出现死亡,剖检鸡法氏囊出现病变,经测序和电镜分析证实IBDV超强毒已成功拯救。将拯救的B节段上不同突变的IBDV超强毒进行SPF鸡攻毒实验,发现将强毒的4位点由V突变为I,可使病毒的致病性增强,将强毒的687位点由P突变为S,可使病毒的致病性增强。VP1具有RNA依赖的RNA聚合酶活性,研究不同位点突变影响病毒复制及致病性的分子机制。构建了基于B节段的minigenome系统,并成功用于检测IBDV的聚合酶活性。通过聚合酶活性检测,发现将IBDV强毒的4位点V突变为弱毒的相应位点I,可使病毒的聚合酶活性升高,而将弱毒的4位点I突变为强毒的相应位点V,病毒的聚合酶活性降低。由此可见,4位点影响病毒复制及致病性的分子机制之一是由于其影响了病毒的聚合酶活性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 鸡传染性法氏囊病研究概况
• 1.1.1 鸡传染性法氏囊病的研究历史
• 1.1.2 鸡传染性法氏囊病的致病性研究
• 1.1.3 鸡传染性法氏囊病的流行病学研究
• 1.1.4 鸡传染性法氏囊病的诊断
• 1.1.5 鸡传染性法氏囊病的防控
• 1.2 鸡传染性法氏囊病病毒
• 1.2.1 IBDV 病毒粒子
• 1.2.2 IBDV 基因组
• 1.2.3 病毒编码蛋白
• 1.3 反向遗传系统
• 1.3.1 几种不同类型的反向遗传系统
• 1.3.2 IBDV 反向遗传系统的建立
• 1.3.3 反向遗传学在IBDV 研究中的应用
• 1.4 决定IBDV 抗原变异，致病性及细胞嗜性的分子基础
• 1.5 IBDV 的B节段研究进展
• 1.6 问题与展望
• 1.7 本研究的目的及意义
• 第二章 IBDV B 节段全长克隆及序列分析
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 病毒，SPF 鸡胚及实验动物
• 2.1.2 主要试剂及引物合成
• 2.1.3 主要仪器
• 2.1.4 病毒的处理及dsRNA 的提取
• 2.1.5 基因组序列的克隆
• 2.1.6 序列比对及进化分析
• 2.1.7 UTR 部分二级结构预测
• 2.1.8 病毒致病性研究
• 2.2 结果
• 2.2.1 B 节段全基因组序列的扩增
• 2.2.2 B 节段全基因组序列分析
• 2.2.3 B 节段进化分析
• 2.2.4 B 节段 UTR 二级结构分析
• 2.2.5 致病性实验
• 2.3 讨论
• 第三章 IBDV VP1 影响弱毒复制位点的鉴定
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 质粒，病毒，细胞，动物
• 3.1.2 主要仪器
• 3.1.3 工具酶及主要试剂
• 3.1.4 引物设计与合成
• 3.1.5 B 节段基因修饰及感染性克隆的构建
• 3.1.6 病毒的拯救
• 3.1.7 拯救病毒的鉴定
• 3.1.8 突变病毒的体外复制动力学分析
• 3.2 结果
• 3.2.1 B 节段基因修饰及感染性克隆的构建
• 3.2.2 拯救病毒的鉴定
• 3.2.3 拯救病毒的复制动力学分析
• 3.3 讨论
• 第四章 IBDV VP1 上突变位点对病毒致病性的影响
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 质粒，细胞，鸡胚，动物
• 4.1.2 主要试剂和工具酶
• 4.1.3 主要仪器
• 4.1.4 vvIBDV 反向遗传操作系统的建立
• 4.1.5 B 节段突变的vvIBDV 的拯救
• 4.1.6 拯救病毒的动物感染实验
• 4.2 结果
• 4.2.1 拯救超强毒株的SPF 鸡病理变化
• 4.2.2 拯救超强毒株的SPF 鸡的法氏囊病理变化
• 4.2.3 RT-PCR 鉴定
• 4.2.4 拯救病毒的电镜鉴定
• 4.2.5 致病性实验
• 4.2.6 病毒的体内复制动力学
• 4.3 讨论
• 第五章 VP1 突变位点影响IBDV 复制及致病性的分子机制
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 质粒，细胞
• 5.1.2 主要仪器
• 5.1.3 主要试剂及工具酶
• 5.1.4 引物的设计与合成
• 5.1.5 基于B 节段的IBDV Minigenome 的构建
• 5.1.6 用Minigenome 系统进行聚合酶活性的检测
• 5.1.7 HLJ-4 株的 VP1 区段突变对聚合酶活性影响的检测
• 5.1.8 HLJ-4 株的VP1 单点突变对聚合酶活性影响的检测
• 5.1.9 Gt 株的 VP1 突变对聚合酶活性影响的检测
• 5.2 结果
• 5.2.1 以HLJ-4 的B 节段为骨架的Minigenome 系统的建立
• 5.2.2 以Gt 的B 节段为骨架的Minigenome 系统的建立
• 5.2.3 以HLJ-4 的B 节段为骨架的Minigenome 系统检测聚合酶活性
• 5.2.4 以 Gt 的 B 节段为骨架的 Minigenome 系统检测聚合酶活性
• 5.2.5 HLJ-4 株的 VP1 上区段突变对聚合酶活性影响的检测
• 5.2.6 HLJ-4 株的 VP1 上单点突变对聚合酶活性影响的检测
• 5.2.7 Gt 株的 VP1 上突变位点对聚合酶活性影响的检测
• 5.3 讨论
• 第六章 全文结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历