几种药用植物内生放线菌的分离、抗菌活性初探及遗传多样性研究

论文摘要

放线菌广泛分布于自然界的各种生态环境,又因为放线菌能够产生多种具有重要的经济价值和广泛的实际用途的天然次生代谢产物而备受国内外学者关注。四川省的地质地貌和气候特征复杂多样,适宜多种多样的药用植物生长。与这些药用植物形成内生关系的放线菌,在长期的共同进化过程中,具有与药用植物相似,或者相同的遗传与代谢特性,极有可能存在可以产生新的活性物质的新的放线菌,因此药用植物内生放线菌作为一类新的微生物资源,具有很好的开发潜力。本研究以四川雅安地区采集的野生药用植物为研究对象,对其内生放线菌的种群和系统发育进行了研究,并对其抗菌活性进行了初探,以期为开发利用野生药用植物内生放线菌资源奠定基础。本研究取得了如下结果：本研究用5种不同的放线菌分离培养基,从四川省雅安市采集的7种野生药用植物中分离出内生放线菌106株。其中改良高氏一号培养基分离得到的放线菌数量最多,分别为33株,柠檬酸盐培养基分离的数量最少。内生放线菌在植株内的分布也有很大差异,其中从根内分离获得了63株放线菌,占分离总数的59.5%,叶中分离的比例最小,仅有7.5%。对42株内生放线菌代表菌株以Haelll、Rsa I两个限制内切酶进行16S rDNA-RFLP分析,再由聚类结果选取10株内生放线菌测定16S rDNA全序列。供试的内生放线菌菌株在66%的相似性上聚在一起。在73%相似水平上,供试的内生放线菌菌株分成了6个ARDRA遗传类型。其中,群Ⅱ是最主要的类群,包含了24株。16S rRNA序列分析表明,分离得到的内生放线菌分布于7个属,分别是链霉菌属（Streptomyces sp.）、厄氏菌属（Oerskovia sp.）、野野村菌属（Nonomuraea.sp.）、小单孢菌属（Micromonospora sp.）、拟诺卡氏菌属（Nocardiopsis）,糖霉菌属（Glycomyces）和纤维菌属（Cellulosimicrobium）。显示了药用植物内生放线菌具有较为丰富的多样性。对分离出的42株内生放线菌代表菌株进行抗菌活性初探发现,供试的42株内生放线菌菌株对2株细菌和9株病原真菌均具有不同程度的抗菌活性。其中,对玉米小斑病（Bipolaris maydis）抑菌效果最佳,90%的菌株具有抑菌活性,最大抑菌圈达到15mm；对西瓜枯萎病（Fusarium oxysporum）、玉米弯孢病（Curvularia lunata）以及禾谷镰刀菌病（Fusarium graminearum）抑制作用较强,抑菌率在70%以上。但对棉花黄萎病（Verticilliam wilt）、大肠杆菌（Escherichia coli）抑菌效果不明显。具有较好抑菌活性的菌株大多数是属于链霉菌属（Streptomyces）。本研究的结果表明,药用植物内蕴藏着种类丰富的内生放线菌,具有不同程度的抗菌活性,该类微生物是寻找新型生物活性物质的重要资源。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1. 前言
• 1.1 植物内生菌
• 1.1.1 植物内生菌的定义
• 1.1.2 内生菌的起源和演化
• 1.1.3 内生菌的分类
• 1.1.4 植物内生菌的生物多样性
• 1.1.5 植物内生菌与宿主的关系及作用
• 1.1.6 植物内生菌应用前景和存在的问题
• 1.2 植物内生放线菌的研究现状 #R
• 1.2.1 放线菌简介
• 1.2.2 放线菌的分类研究
• 1.2.3 植物内生放线菌的分离方法
• 1.3 DNA分子标记技术的应用
• 1.3.1 RFLP
• 1.3.2 RAPD（Random Amplied Polymorphism DNA）
• 1.3.3 AFLP（Amplifed Fragment Length Polymorphism）
• 1.3.4 SSR（Simple Sequence Repeat）
• 1.3.5 ISSR（Inter Simple Sequence Repeat）
• 1.4 本研究的目的和意义
• 2. 材料与方法
• 2.1 供试材料
• 2.1.1 样品采集
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 实验试剂及主要仪器
• 2.2 野生药用植物内生放线菌的分离
• 2.2.1 样品保存
• 2.2.2 样品的预处理
• 2.2.3 植物表面消毒
• 2.2.4 表面消毒有效性检测
• 2.2.5 内生放线菌的分离
• 2.2.6 内生放线菌的平板划线纯化
• 2.2.7 内生放线菌的菌种保存
• 2.2.8 内生放线菌的形态观察
• 2.3 野生药用植物内生放线菌的多样性分析和分子鉴定
• 2.3.1 药用植物内生放线菌的基因组DNA提取
• 2.3.2 内生放线菌16S rDNA的PCR扩增
• 2.3.3 16S rDNA PCR-RFLP指纹图谱分析
• 2.3.4 16S rDNA产物纯化与测序分析
• 2.4 内生放线菌株抗菌活性的初探
• 2.4.1 细菌指示菌的抗菌活性实验
• 2.4.2 病原真菌指示菌的抗菌活性实验
• 2.5 数据处理
• 2.5.1 16S rDNA PCR-RFLP酶切图谱数据分析处理
• 2.5.2 药用植物内生放线菌16S rDNA序列结果分析
• 2.5.3 药用植物内生放线菌序列号
• 3 实验结果与分析
• 3.1 表面消毒效果
• 3.2 药用植物内生菌的分离
• 3.3 内生放线菌的形态观察
• 3.4 内生放线菌16S rDNA的PCR扩增结果
• 3.5 内生放线菌16S rDNA的PCR-RFLP
• 3.6 药用植物内生放线菌16S rDNA的序列分析
• 3.7 抗菌活性
• 4. 讨论
• 4.1 药用植物内生放线菌分离
• 4.2 药用植物内生放线菌的多样性
• 4.3 药用植物内生放线菌抑菌活性
• 5. 结论
• 参考文献
• 致谢