人巨细胞病毒DNA疫苗的构建及诱导小鼠的免疫应答

论文摘要

目前,国际上仍未获得一种安全有效的HCMV疫苗,和其他大多数的急性病毒感染不同,机体的自然免疫反应不能消灭HCMV。对HCMV来说,最有效的疫苗应该是那些既能刺激体液免疫又能刺激细胞免疫的疫苗。DNA疫苗的突出特点是抗原蛋白由细胞内部合成,与病毒自然感染相似,诱导机体产生体液免疫和细胞免疫过程。本研究选择了HCMV AD169株pp65蛋白基因作为候选基因,制备DNA疫苗。首先提取人巨细胞病毒AD169株基因组,以其为模板分别扩增出pp65基因,构建真核表达载体pVAX1/pp65。经双酶切鉴定和DNA序列测定正确后,大量提取并经Sepharose 4FF柱层析纯化载体后,肌肉注射免疫BALB/c小鼠,设立空载体pVAX1为阴性对照组。用ELISA方法检测结果表明HCMV DNA疫苗能够诱导小鼠产生抗人巨细胞病毒的体液免疫应答,在第6周时达到1:80,并且持续时间较长。在淋巴细胞增殖试验中,ConA刺激指数均值为1.748±0.051,而空载体对照组为1.095±0.060。小鼠脾淋巴细胞转化实验/MTT法评价其诱导的细胞免疫效果。试验结果表明,质粒DNA疫苗pVAX1/pp65m能够诱导BALB/c小鼠产生特异性免疫应答。

论文目录

• 内容提要
• 第一章 前言
• 1.1 核酸疫苗的免疫机理
• 1.2 人巨细胞病毒的研究现状
• 1.2.1 HCMV 的一般特征
• 1.2.2 HCMV 感染的危害性
• 1.3 HCMV 疫苗研究开发的可行性和必要性
• 1.4 实验设计方案
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验材料、试剂和仪器
• 2.1.1 材料
• 2.1.1.1 毒株、细胞、菌株及质粒
• 2.1.1.2 实验动物
• 2.1.1.3 限制性内切酶及其他酶类
• 2.1.1.4 试剂盒
• 2.1.1.5 试剂
• 2.1.2 主要仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 HCMV pp65 基因的获得
• 2.2.1.1 HCMV AD169 株基因组DNA 的提取
• 2.2.1.2 HCMV pp65 基因的PCR 扩增
• 2.2.1.3 PCR 反应产物的回收
• 2.2.2 克隆载体的构建
• 2.2.3 真核表达载体的构建
• 2.2.4 质粒大量提取和纯化
• 2.2.4.1 质粒的大量提取
• 2.2.4.2 Sepharose 4FF 柱层析纯化质粒
• 2.2.5 免疫小鼠
• 2.2.6 HCMV 抗体的检测
• 2.2.7 脾淋巴细胞转化实验
• 第三章 结果与讨论
• 3.1 HCMV pp65 基因的扩增
• 3.2 质粒pMD18-T/pp65 酶切鉴定
• 3.3 重组真核表达载体pVAX1/pp65 的酶切鉴定
• 3.4 重组真核表达载体pVAX1/pp65 的PCR 鉴定结果
• 3.5 Sepharose 4 FF 柱层析法纯化质粒
• 3.6 质粒DNA 疫苗诱导BALB/c 小鼠体液免疫结果
• 3.7 脾淋巴细胞转化实验结果
• 3.8 讨论
• 3.8.1 HCMV DNA 疫苗候选基因的选择
• 3.8.2 表达载体（pVAX1）的选择
• 3.8.3 免疫途径和剂量
• 3.8.4 疫苗的免疫效果
• 3.8.5 优势和展望
• 结论
• 参考文献
• 中文摘要
• Abstract
• 致谢