牛角的形态发生及其真皮乳头cDNA表达文库的构建

论文摘要

牛角由额骨的骨质突与特化的角质外壳构成,是皮肤的衍生物。角发生于胎牛额部角原基,资料显示,角原基约在胚龄70～100天时出现。角原基的形态发生过程与其它皮肤衍生物相似,是上皮-间充质相互作用的结果。研究牛角的形态发生及其信号调控,不仅可为发育生物学器官形态发生过程中,上皮-间充质相互作用机理的研究提供新的模型,对毛囊生物学的研究也具有重要理论意义和参考价值。本试验研究材料为18头胚龄E85-280d的公牛胚胎及五对2～3岁成年公牛角。通过对胎牛角原基与成年牛角真皮进行组织切片HE染色、β-catenin的免疫组织化学以及构建生长期牛角真皮乳头cDNA表达文库,初步研究了胎牛角原基的形态变化过程及成年牛角真皮结构特点,检测了β-catenin在各胚龄胎牛角原基中的表达,并对其在角原基形态发生过程中的作用进行了探讨,为进一步研究真皮乳头的功能基因在牛角形态发生中的作用也奠定了基础。结果和结论如下:1、组织切片HE染色结果表明:角原基表皮厚度随胎龄增加逐渐变薄,表皮细胞形态由规则向不规则过渡,毛囊发育较身体其它部位早,且体积较大。牛胚胎早期（E85～140d）,角原基表皮平均厚度最大,基底层细胞为单层柱状,其他细胞呈多边形,细胞核质比小;牛胚胎中期至中后期（E141～210d）,表皮平均厚度逐渐减小,细胞体积亦减小,仍然呈多边形,核质比增大,大部分毛囊已发育成熟,毛干正在形成或已经顶出皮肤;牛胚胎后期（E211～280d）,表皮总厚度最薄,但角质层增厚,细胞形状不规则,表皮各层结构界限模糊。成年牛角真皮厚度由角根部向上逐渐变薄,到顶部又变厚,其表面有很多真皮乳头,角基部的乳头短而密,向上则逐渐变长变稀,至角顶部又变密。真皮乳头紧紧嵌入角质外壳内层壁中。2、β-catenin免疫组化研究表明:角原基β-catenin的表达随胎龄的增加从表皮基底层细胞到所有表皮细胞,且阳性逐渐增强,毛囊持续表达β-catenin。牛胚胎早期,β-catenin在基底层细胞胞浆表达为阳性,其它表皮细胞膜表达呈阳性而胞浆为弱阳性,毛囊隆突区、毛母质和外根鞘均有表达;牛胚胎中期,β-catenin在所有表皮细胞胞浆及部分细胞核中为阳性,其表达持续存在于毛囊隆突区、毛母质和外根鞘,且外根鞘表达增强;牛胚胎后期,β-catenin的表达为强阳性,毛囊结构及其中β-catenin的表达均未发生明显变化。3、成功构建了牛角真皮乳头cDNA表达文库,初级文库的库容量为6.07×105,重组率高达93%,扩增后,文库滴度为4×107 pfu/ml。根据美国Clontech公司的质量标准（原始文库的重组子数目为5×105-5×108个克隆,重组率大于90%,插入cDNA片段不小于0.3kb）我们所构建的文库质量良好,可以涵盖与重要功能蛋白相对应的稀有mRNA的克隆,为进一步研究真皮乳头的功能基因在牦牛角形态发生过程中的作用奠定基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 哺乳动物皮肤衍生物形态发生的研究进展
• 1.1 皮肤衍生物的形态发生
• 1.1.1 毛囊的形态发生
• 1.1.2 牙齿的形态发生
• 1.2 皮肤衍生物形态发生的分子机理
• 1.2.1 诱导皮肤衍生物发生的旁分泌因子
• 1.2.2 毛囊周期及其调控
• 1.2.3 牙齿形态发生的分子机理
• 1.3 角的形态发生及其研究进展
• 第二章 胎牛角原基及成年牛角真皮组织的形态学研究
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 动物
• 2.1.2 试剂
• 2.1.3 仪器
• 2.1.4 组织的准备
• 2.1.5 各组织石蜡切片的制作
• 2.1.6 石蜡切片HE 染色
• 2.2 结果
• 2.3 讨论
• 第三章 Β－CATENIN 在胎牛角原基发育过程中的表达
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 动物
• 3.1.2 试剂
• 3.1.3 仪器
• 3.1.4 胎牛角原基处皮肤组织的准备
• 3.1.5 组织石蜡切片的制作
• 3.1.6 免疫组织化学
• 3.1.7 结果判定
• 3.2 结果
• 3.3 讨论
• 第四章 牛角真皮乳头CDNA 表达文库的构建
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 动物
• 4.1.2 试剂
• 4.1.3 仪器
• 4.1.4 总RNA 的提取
• 4.1.5 mRNA 的分离纯化
• 4.1.6 cDNA 第一链、第二链的合成
• 4.1.7 连接载体
• 4.1.8 体外包装
• 4.1.9 初级文库的重组率测定
• 4.1.10 文库的扩增及滴度测定
• 4.2 结果
• 4.2.1 组织样品的分离纯化
• 4.2.2 总RNA 纯度及完整性检测与mRNA 的纯化
• 4.2.3 cDNA 的分级分离
• 4.2.4 初级文库重组率与扩增文库滴度的测定
• 4.2.5 牛角真皮乳头cDNA 表达文库构建的意义
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介