黄芪多糖对四氯化碳诱导鲤鱼肝（细胞）损伤的保护作用

论文摘要

目前,由于环境污染,高蛋白、高脂肪或霉变饲料的使用、抗生素和杀虫剂的滥用等因素引起的鱼类肝胆综合症在全国许多地区频繁发生,造成了鲤、鲫、草鱼、团头鲂和青鱼等多种鱼类的大面积死亡,死亡率高达60-90%,给水产养殖业造成极大的经济损失。因此,筛选保肝药物对水产动物健康养殖具有十分重要的意义。本实验通过建立体内和体外两种急性肝损伤模型,探讨了黄芪多糖（APS）对四氯化碳（CCl4）诱导鲤鱼的肝（细胞）损伤的保护和抗氧化应激的影响。主要研究内容和结果如下：1鲤鱼肝细胞原代培养：通过不同的分离方法和培养条件探索鲤鱼肝细胞的原代培养,以建立稳定的鲤鱼肝细胞原代培养模型,同时观察长期培养过程中肝细胞的形态变化。结果显示：组织块贴壁培养4-5天后细胞从组织块中迁出并增殖；机械分散法收集的细胞少,细胞存活率低；而胰蛋白酶消化法获得良好稳定的分离和培养效果。用0.1%胰蛋白酶消化30min,经台盼蓝染色和血球计数板计数,每克肝重可收集1.47×108个细胞,平均存活率为91.43%。培养基和血清浓度均会影响肝细胞的贴壁和生长。在含有10%（V/V）功胎牛血清（FCS）M199培养基中,于4%CO2、28℃培养8-9天并传代。2鲤鱼肝细胞损伤模型和在体肝损伤模型的建立：体外肝细胞损伤模型：用浓度为0、2、4、8、16和32mM/mL的CCl4损伤鲤鱼原代肝细胞,4h后,检测肝细胞的存活率和细胞上清液中的LDH、GPT、GOT、MDA和SOD。结果显示,和对照组相比,用8、16和32mM/mL的CCl4处理的细胞存活率明显降低（P<0.05或P<0.01）,细胞上清液中的LDH、GPT、GOT、MDA和SOD发生显著的变化（P<0.05或P<0.01）,而2和4mM/mL的CCl4对肝细胞损伤不明显。在体肝损伤模型：用浓度为0、12.5%、25%、30%和50%（V/V）的四氯化碳-植物油混合液,按5mL/kg鱼体重的剂量,腹腔注射鲤鱼,注射后的不同时间收集血清,检测肝损伤程度。结果显示,12.5%的CCl4对肝组织没有的影响,50%的CCl4会使鲤鱼致死,25%和30%的CCl4均能造成严重的肝损伤。在体外采用8mM/mL的CCl4作用4h建立肝细胞损伤模型；在体内,以30%的CCl4损伤肝组织72h建立肝损伤模型。3黄芪多糖对鲤鱼肝损伤的影响：分别利用8mM/mL的四氯化碳作用肝细胞4h及腹腔注射30%四氯化碳-植物油混合液5mL/kg来构建鲤鱼的离体肝细胞和整体肝损伤模型,通过检测肝细胞培养上清液、血清和肝组织匀浆中LDH、GOT、 GPT、MDA、GSH、SOD等生化指标的含量及肝细胞增殖活性来研究黄芪多糖(（Astraga lus polysaccharides, APS）对四氯化碳诱导的急性肝（细胞）损伤的保护和抗氧化作用。实验结果表明：黄芪多糖可抑制四氯化碳损伤引起的肝细胞培养上清中GPT、GOT、LDH活性和MDA含量的升高,显著提高SOD及肝细胞的存活率（P<0.05或P<0.01）；同时在体内试验中,黄芪多糖可以显著降低四氯化碳损伤导致的血清中GPT、GOT、LDH活性升高；显著提高TP、Alb含量；显著提高肝组织匀浆中GSH含量、T-AOC和SOD活性,降低MDA含量（P<0.05或P<0.01）。该结果表明黄芪多糖对鲤鱼肝脏有保护作用,该保护作用可能与其抗氧化,清除自由基能力有关。因此,黄芪多糖可作为一种鱼类保肝和抗氧化药物。

论文目录

• 目录
• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1 鱼类肝细胞的培养与应用
• 1.1 鱼类肝细胞的分离和培养
• 1.1.1 鱼类肝细胞的分离
• 1.1.2 鱼类肝细胞的培养
• 1.2 影响鱼类肝细胞培养的因素
• 1.2.1 肝细胞来源
• 1.2.2 培养环境
• 1.2.3 培养基
• 1.2.4 添加物
• 1.3 鱼类肝细胞培养的应用
• 1.3.1 生理生化功能研究
• 1.3.2 环境毒理学研究
• 1.3.3 药理学研究
• 2 肝损伤模型的建立应用
• 2.1 四氯化碳肝损伤模型
• 2.2 酒精性肝损伤机制
• 2.3 药物性肝损伤
• 3 黄芪多糖药理作用研究
• 3.1 对免疫系统的作用
• 3.1.1 对巨噬细胞的调节作用
• 3.1.2 对NK细胞和细胞因子的影响
• 3.2 抑制病毒和抗肿瘤作用
• 3.3 对心肌和心血管系统的影响
• 3.4 抗氧化作用和抗应激作用
• 4 黄芪及其多糖在水产中应用
• 4.1 对水产动物免疫力影响
• 4.2 对水产动物生长的影响
• 4.3 对水产动物病害防治
• 5 黄芪多糖的保肝现状研究
• 6 实验目的和意义
• 第二章 肝细胞原代培养
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 试验用鱼
• 1.1.2 试剂
• 1.1.3 仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 组织块培养法
• 1.2.2 酶消化法
• 1.2.3 机械分散法
• 1.3 肝细胞数量和活力的测定
• 1.3.1 细胞数量测定
• 1.3.2 细胞存活率测定
• 1.3.3 WST-1测定细胞活力
• 1.4 传代培养
• 2 结果与分析
• 2.1 胰蛋白酶消化法和机械分散法对肝细胞数量和存活率的影响
• 2.2 胰蛋白酶消化法和机械分散法对肝细胞活力的影响
• 2.3 培养基和血清浓度对鲤鱼肝细胞活力的影响
• 2.4 肝细胞形态观察
• 3 讨论
• 3.1 细胞除菌处理和杂细胞的去除
• 3.2 分离方法
• 3.3 培养方法
• 第三章 肝（细胞）损伤模型的构建
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 实验用鱼
• 1.1.2 试剂
• 1.1.3 仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 鲤鱼肝细胞的分离
• 4致原代肝细胞损伤'>1.2.2 CCl₄致原代肝细胞损伤
• 4诱导的鲤鱼肝组织损伤模型的建立'>1.2.3 CCl₄诱导的鲤鱼肝组织损伤模型的建立
• 2 结果分析
• 4对鲤鱼肝细胞活力的影响'>2.1 CCl₄对鲤鱼肝细胞活力的影响
• 4对鲤鱼肝细胞LDH、GPT和GOT活性的影响'>2.2 CCl₄对鲤鱼肝细胞LDH、GPT和GOT活性的影响
• 4对鲤鱼肝细胞MDA、SOD和GSH-PX的影响'>2.3 CCl₄对鲤鱼肝细胞MDA、SOD和GSH-PX的影响
• 4对鲤鱼血清中GPT,GOT和LDH活性的影响'>2.4 不同浓度的CCl₄对鲤鱼血清中GPT,GOT和LDH活性的影响
• 4对鲤鱼肝组织中SOD活性和MDA含量的影响'>2.5 不同浓度的CCl₄对鲤鱼肝组织中SOD活性和MDA含量的影响
• 3. 讨论
• 第四章 黄芪多糖对四氯化碳诱导鲤鱼肝（细胞）损伤的保护和抗氧化作用
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 实验用鱼
• 1.1.2 试剂和仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 黄芪多糖的处理
• 1.2.2 体外实验
• 1.2.3 在体实验
• 1.3 数据分析
• 2 结果与分析
• 4损伤鲤鱼原代肝细胞的保护作用'>2.1 APS对CCl₄损伤鲤鱼原代肝细胞的保护作用
• 2.1.1 对肝细胞活力的影响
• 2.1.2 对肝细胞中GOT,GPT和LDH活性的影响
• 2.1.3 对肝细胞中SOD活性和MDA含量的影响
• 4致鲤鱼肝组织损伤的保护作用'>2.2 APS对CCl₄致鲤鱼肝组织损伤的保护作用
• 2.2.1 对鲤鱼血清中GPT、GOT和LDH活性的影响
• 2.2.2 鲤鱼血清TP和Alb的影响
• 2.2.3 肝组织匀浆中生化指标的影响
• 3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的论文
• 附录