荧光假单胞菌抗铜基因簇的表达调控及其致病性分析

2020-12-07阅读(182)

论文摘要

CopRS/CopABCD是细菌用以维持铜内环境稳定的一个系统,虽然已在荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)中发现了CopRS/CopABCD系统的同源物,但其潜在的功能还未知。本实验在一个鱼类致病菌P. fluorescens(TSS)中鉴定到了一个基因簇,由copR、copS、copC和copD组成,但缺乏copAB。copR、copS、copC和copD基因的敲除实验发现copRSCD基因簇与TSS抗铜性相关,而且copRS操纵子和copCD操纵子在转录水平上受亚抑制水平的铜诱导。双元调控系统中的调控蛋白CopR不仅激活copCD表达,而且还激活copRS的表达。凝胶滞缓实验显示CopR能直接与copCD和copRS的启动子区域结合。干扰copR的正常表达不仅影响细菌的生长,而且还影响到细菌生物膜的形成、对鱼的侵染力和在组织中的存活力。本实验还筛选到一个CopR的突变体C104,该突变体因缺失N端的信号接受域而成为一个具有组成性活性的调控蛋白,C104在TSS中表达时导致菌株的毒力降低。本实验所发现的P. fluorescens CopR与细菌致病力之间的关系以前未见报道。

论文目录

摘要

Abstract

第一章前言

1.1 荧光假单胞菌概述

1.1.1 荧光假单胞菌形态与生化特征

1.1.2 荧光假单胞菌的分布

1.1.3 荧光假单胞菌引起的病害

1.2 假单胞菌重金属耐受性和金属体内平衡

1.2.1 金属体内平衡的维持

1.2.2 金属的吸收和螯合作用

1.2.3 类金属P型ATP酶

1.2.4 金属外排作用

1.2.5 金属体内平衡维持的调控蛋白

1.3 微生物抗铜基因研究进展

1.3.1 细菌抗铜基因及其作用方式

1.3.2 耐铜基因的调节

1.3.3 抗铜基因与致病性

1.4 双元调控系统

1.4.1 组氨酸蛋白激酶（HK）

1.4.2 反应调节蛋白（RR）

1.5 本研究的目的、意义

第二章 TSS抗铜基因操纵子的筛选与克隆

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.2.1 TSS 3-6 kb DNA片段的文库构建

2.2.1.1 TSS基因组DNA的提取

2.2.1.2 TSS基因组DNA Sau3AI酶切

2.2.1.3 目的片段的胶回收

2.2.1.4 pBU载体的酶切及去磷酸化处理

2.2.1.5 载体与目的片段的连接

2.2.1.6 重组质粒的转化

2.2.1.7 阳性克隆的酶切鉴定和测序

2.2.2 TSS染色体步移文库的构建

2.2.3 TSS抗铜基因簇copRSCD基因的克隆

2.2.4 copCD共转录的验证

2.2.4.1 TSS RNA提取

2.2.4.2 RNA 的DNA污染检测

2.2.4.3 cDNA的合成

2.2.4.4 copCD共转录RT-PCR验证

2.3 实验结果

2.3.1 基因组DNA提取结果

2.3.2 TSS 3-6 kb DNA片段的文库构建及其抗铜基因的筛选

2.3.3 TSS染色体步移文库的构建

2.3.4 TSS抗铜基因簇copRSCD基因的克隆

2.3.5 TSS RNA 提取及RT-PCR

2.3.6 copRSCD邻近基因排布

2.4 分析与讨论

第三章 TSS抗铜基因copRSCD的敲除及抗铜性分析

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.2.1 copR和copC的缺失

3.2.1.1 引物设计

3.2.1.2 Overlap PCR产生copR和copC缺失片段

3.2.1.3 重组自杀质粒的构建

3.2.1.4 TSS与自杀质粒的菌株接合转移

3.2.1.5 二次交换及缺陷株筛选

3.2.2 copS、copD和orf342 的插入失活

3.2.2.1 交换区目的片段的克隆

3.2.2.2 目的片段的T4 多聚核苷酸激酶处理

3.2.2.3 目的片段与自杀性载体p7T连接、转化

3.2.2.4 自杀性重组质粒与TSS的接合转移

3.2.3 copR和copC过量表达菌株的构建

3.2.3.1 目的基因的克隆

3.2.3.2 目的基因与中间载体pBT的连接

3.2.3.3 copR和copC过量表达载体的构建

3.2.3.4 copR和copC过量表达菌株的构建

3.2.4 TSSRM和TSSCM的互补菌株的构建

3.2.5 抗铜MIC值测定

3.2.6 生长状况分析

3.3 实验结果

3.3.1 Overlap PCR产生copR和copC缺失片段

3.3.2 重组自杀质粒p7TSRM和p7TSCM的构建

3.3.3 copR和copC缺陷株筛选

3.3.4 copS、copD和orf342 的插入失活

3.3.5 copR和copC过量表达菌株的构建

3.3.6 TSSRM和TSSCM的互补菌株的构建

3.3.7 抗铜MIC值测定

3.3.8 生长状况分析

3.4 分析与讨论

3.4.1 基因缺失突变

3.4.2 copS、copD和orf342 的插入失活

3.4.3 copR和copC过量表达菌株的构建

3.4.4 TSS 及其衍生菌株的抗铜性

3.4.5 TSS 及其衍生菌株的生长状况

第四章抗铜操纵子表达调控分析

4.1 实验材料

4.2 实验方法

4.2.1 pBTR对copC和copR的启动子的调控

4.2.1.1.c opC和copR启动子的克隆

4.2.1.2 重组质粒pSD601 和pSD210 的构建

4.2.1.3 pBTR与启动子的相互作用

4.2.1.4 启动子活性检测

4.2.2 启动子D601 和D210 体内活性研究

4.2.2.1 载体p181 的构建

4.2.2.2 pJT601 和pJT210 的构建

4.2.2.3 D601 和D210 体内活性测定

4.2.3 Cu对copC和copR的诱导表达

4.2.3.1 细胞的收集

4.2.3.2 RNA提取

4.2.3.3 cDNA的合成

4.2.3.4 Realtime PCR

4.2.4 其他金属离子对copC和copR的诱导表达

4.2.5 CopR对copC的表达调控

4.2.6 CopR对copR的表达调控

4.2.7 CopR与D601 和D210 的相互作用

4.2.7.1 copR基因的克隆

4.2.7.2 CopR原核诱导表达载体的构建

4.2.7.3 CopR诱导表达菌株的构建

4.2.7.4 CopR蛋白诱导表达

4.2.7.5 SDS-PAGE分析

4.2.7.6 重组蛋白的纯化

4.2.7.7 凝胶滞缓实验（EMSA）

4.2.8 CopR缺失突变

4.2.8.1 copR突变基因的克隆

4.2.8.2 CopR缺失突变的功能鉴定

4.2.8.3 TSS/pJC104 和TSSRM/pJC104 的构建

4.2.8.4 TSS/pJC104 和TSSRM/pJC104 生长状况的分析

4.2.8.5 TSS/pJC104 和TSSRM/pJC104 对copC的表达调控

4.3 实验结果

4.3.1 CopR对copC和copR的启动子的作用

4.3.2 启动子D601 和D210 体内活性研究

4.3.3 Cu对copC和copR的诱导表达

4.3.4 CopR调控copC和copR的表达

4.3.5 CopR与D601 和D210 的相互作用

4.3.6 CopR缺失突变株的功能鉴定

4.4 分析与讨论

4.4.1 CopR对D601 和D210 活性

4.4.2 启动子D601 和D210 体内活性研究

4.4.3 copC和copR转录水平的研究

4.4.4 CopR与D601 和D210 的相互作用

4.4.5 CopR缺失突变

第五章抗铜基因对TSS致病性分析

5.1 实验材料

5.2 实验方法

5.2.1 copR缺失及过量表达菌株对牙鲆致病力的比较

5.2.2 质粒的稳定性检验

5.2.3 copR缺失及过量表达菌株生物膜形成能力的比较

5.3 实验结果

5.4 分析与讨论

结论

参考文献

博士期间发表的论文和申请的专利

致谢

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标签：抗铜性论文; 荧光假单胞菌论文; 毒力论文;

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