草鱼PepT1与PepT2基因全长cDNA克隆和PepT2组织表达研究

论文摘要

PepTl与PepT2属于POT （Proton-coupled oligopeptide transporter）家族中的两种不同的小肽转运载体。它们在细胞中利用质子梯度推动二肽和三肽等寡肽的吸收,PepT1主要在小肠中表达,吸收食物中分解的小肽,而PepT2主要在肾脏和大脑中表达,在肾小管对小肽进行重吸收,以及吸收一些β内酰胺抗生素、氨肽酶等类肽物。本研究根据Genebank上登录的斑马鱼、鲈鱼、鲑鱼、人、鼠、兔等基因序列的保守区设计引物,扩增PepT1和PepT2部分序列,并进行克隆测序。经美国国立生物技术信息中心（NCBI）同源性软件BLASTN、BLASTX和TBLASTX搜索确定为目的基因后,在已知序列上设计5′、3′特异性引物,利用RACE基因末端快速克隆法克隆出草鱼5′端和3′端,通过拼接得到PepT1、PepT2基因全长cDNA序列。结果得到草鱼PepT2基因cDNA全长2733bp,其中开放阅读框ORF长2196bp,编码722个氨基酸残基,5′端非编码区长82bp,3′端非编码区长482bp；PepT2预测氨基酸同源性分析显示草鱼PepT2和斑马鱼的同源性为86%,与哺乳动物的同源性也很高,在55%-58%之间,其中与家鼠的同源性最低为55%。得到草鱼PepT1基因cDNA全长2456bp,其ORF长2160bp,编码719个氨基酸残基,5′端非编码区（UCR）长135bp,3′非编码区长161bp；氨基酸同源性结果表明,草鱼PepT1与鲫鱼的同源性最高为80%,其中与中国仓鼠的最低为53%,而草鱼PepT1与草鱼PepT2的同源性仅仅为48%。根据草鱼PepT2基因设计特异性RT引物,以β肌动蛋白（β-actin）为内标基因,采用半定量RT-PCR技术对肠道、肾脏、头肾、脑、肝脏、肌肉、心脏和鳃等各组织PepT2mRNA水平进行分析,结果显示,草鱼各组织PepT2mRNA表达水平从高到低依次为肾、肠道、脑、头肾、肝脏、肌肉、而在心脏和腮中未检测到信号。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 前言
• 1 小肽在鱼类生长中的作用
• 1.1 促进氨基酸的吸收,提高动物的生产性能
• 1.2 促进动物吸收微量元素,提高矿物质元素利用率
• 1.3 增强鱼的免疫力,提高成活率
• 2 小肽转运蛋白PepT1研究进展
• 2.1 PepT1转运的动力学特征与吸收特点
• 2.2 鱼类PepT1基因的克隆及其分子特征
• 2.3 鱼类PepT1基因的组织表达
• 3 小肽转运蛋白PepT2研究进展
• 3.1 小肽PepT2的吸收特点
• 3.2 PepT2基因的克隆及其分子特征
• 3.3 PepT2基因的组织表达
• 3.3.1 PepT2基因的组织分布
• 3.3.2 PepT2的表达调控
• 4 本研究的目的与意义
• 第二章 草鱼PepT2基因全长克隆与组织表达
• 1 材料
• 1.1 实验动物与菌株
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器设备
• 1.4 引物设计
• 2 实验方法
• 2.1 动物材料获得
• 2.2 总RNA的提取
• 2.3 PepT2 cDNA部分片段克隆
• 2.3.1 cDNA第一链的合成
• 2.3.2 PCR 扩増
• 2.3.3 目的片段回收
• 2.3.4 目的片段与pUCm-T连接
• 2.3.5 DH5α感受态制备与转化
• 2.3.6 蓝白斑筛选、阳性鉴定及送检测序
• 2.4 PepT23′端和5′端片段扩增和克隆
• 2.4.1 PepT23′RACE-Ready cDNA与5′RACE-Ready cDNA合成
• 2.4.2 RACE PCR扩增及片段回收
• 2.5 PepT2序列拼接
• 2.6 PepT2全长序列分析
• 2.6.1 生物学信息分析
• 2.6.2 序列同源性比对与系统发育树的构建
• 2.7 PepT2组织表达
• 3 结果与分析
• 3.1 总RNA提取效果
• 3.2 草鱼PepT2基因全长cDNA克隆
• 3.2.1 草鱼PepT2中间片段的克隆
• 3.2.2 草鱼PepT2 3'端与5'端的克隆
• 3.3 草鱼PepT2基因全长生物学分析
• 3.3.1 草鱼PepT2基因全长拼接与分析
• 3.3.2 PepT2预测蛋白质生物学分析
• 3.3.3 PepT2氨基酸同源性分析
• 3.3.4 草鱼PepT2的系统进化分析
• 3.4 草鱼PepT2基因组织表达
• 4 讨论
• 4.1 草鱼小肽转运载体PepT2的结构与功能
• 4.2 草鱼PepT2的组织表达差异
• 第三章 草鱼PepT1基因全长克隆与序列分析
• 1 材料
• 1.1 实验动物与菌株
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器设备
• 1.4 引物设计
• 2 实验方法
• 2.1 动物材料获得
• 2.2 总RNA的提取
• 2.3 PepT1 cDNA部分片段克隆
• 2.3.1 cDNA第一链的合成
• 2.3.2 PepT1片段PCR扩增
• 2.3.3 目的片段回收
• 2.3.4 目的片段与pUCm-T连接
• 2.3.5 DH5α感受态制备与转化
• 2.3.6 蓝白斑筛选、阳性鉴定及送检测序
• 2.4 PepT13′端和5′端片段扩增和克隆
• 2.4.1 PepT1 3′RACE-Ready cDNA与5′RACE-Ready cDNA合成
• 2.4.2 RACE PCR扩增
• 2.5 PepT1序列拼接
• 3 结果与分析
• 3.1 总RNA提取效果
• 3.2 草鱼PepT1基因全长cDNA克隆
• 3.2.1 草鱼PepT1部分片段的克隆
• 3.2.2 草鱼PepT13’端与5’端的克隆
• 3.3 草鱼PepT1基因全长生物学分析
• 3.3.1 PepT1基因全长拼接与序列分析
• 3.3.2 PepT1预测蛋白质生物学分析
• 3.3.3 PepT1氨基酸同源性分析
• 3.3.4 草鱼PepT1的系统进化分析
• 4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢