论文摘要
非酒精性脂肪性肝炎（Nonalcoholic steatohepatitis，NASH）属于非酒精性脂肪性肝病（Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD），为现今社会的高发疾病。NASH不仅与动脉粥样硬化、糖尿病等肥胖症并发症紧密相关，而且约20%的NASH患者会发展为肝硬化，其中8%的肝硬化患者甚至可以发展为肝癌。另外，NASH的高发人群已呈现出由中老年为主逐渐向中青年过渡的趋势。虽然已有多个国家和地区的医学组织公布了NASH的治疗指南，但是目前针对NASH的治疗方法有限，尚无特异性治疗方案。关于NASH发病机制的研究比较有限，其中被学者所广泛接收的即是“二次打击”学说。第一次打击是指各种原因导致的肝脏脂肪蓄积及肝细胞脂肪变性。二次打击即是指一次打击所触发的细胞毒素事件，最终导致肝脏炎症的发生。其中，细胞毒素事件包括众多致病因素如氧化应激、胰岛素抵抗和免疫细胞的激活等。新近研究表明NASH炎症进一步发展的重要环节可能为高脂饮食导致的体内抑制炎症作用的调节性T细胞（Regulatory T cells，Tregs）数量减少而不能建立起有效的免疫应答。同时，在体内脂类代谢异常所产生的新生抗原（如热休克蛋白60，HSP60等）的刺激下具有促进炎症作用的效应性T细胞（Effector T cells，Teffs）激活而启动连环打击诱发NASH。免疫耐受疫苗（Tolerogenic vaccine, TV）即为一种新兴的通过使机体产生抗原特异性Tregs而诱导免疫耐受的治疗方法。其方法为在应用免疫抑制剂（例如糖皮质激素）作为免疫耐受佐剂的前提下，应用目标蛋白MHCII限制性抗原肽建立耐受性免疫应答。故此，我们推测如果能应用免疫耐受疫苗预先建立抗原特异性Tregs免疫应答即会在高脂饮食过程中改变体内Tregs与Teffs的不平衡应答状态，从而抑制NASH发生。本实验首先选取C57BL/6和BALB/C小鼠作为研究对象，应用流式细胞术CD11c和CD40双染策略分析了在地塞米松作用下体内抗原提呈细胞（Antigen presenting cell，APC）的变化情况。结果显示脾脏、淋巴结及外周血中均有两个主要的CD11c+CD40+细胞亚群：CD11clow与CD11chigh，并且同CD11chigh相比，CD11clow（我们将其命名为Dex-APC）对地塞米松相对耐受。进一步研究显示给予地塞米松（4.5mg/kg，s.c.）24h后，在脾脏中，约75%的CD11clow细胞存活，约有5%的CD11chigh细胞存活；在肝脏中，大部分MHCII+细胞均被地塞米松清除，CD11clow与CD11chigh细胞存活率均约为5%。地塞米松对抗原提呈细胞的筛选作用的最适浓度可能为4.5mg/kg，其作用可以维持近4天左右，峰值出现在注射后1-2天。本研究应用流式细胞术进一步分析了CD11clow（Dex-APC）细胞的表面谱系标志。结果示Dex-APC为Ly6ClowCD62Llow提示其为单核细胞来源；CD83lowF4/80highCD68high提示其为未成熟巨噬细胞。并且Dex-APC为MHCII类分子及CD86共刺激分子阳性提示其具备通过抗原性及共刺激信号受体激活T细胞增殖的能力。随后我们应用免疫磁珠细胞分选技术（MACS）将小鼠体内CD11clow（Dex-APC）和CD11chigh细胞分别分离，应用实时荧光定量PCR技术检测不同细胞的糖皮质激素受体GR与GR的表达情况。结果示CD11clow（Dex-APC）细胞GR：GR约为CD11chigh细胞7倍左右，可能为其对地塞米松耐受的原因。随后我们应用过继性细胞转移技术将已结合OVA323-339的抗原提呈细胞作为供体植入OVA致敏的Foxp3-eGFP小鼠，然后分离出受体小鼠的脾脏细胞应用5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）技术来分析CD4+T细胞的增殖情况。结果示供体小鼠未经Dex处理而分离出的已结合OVA323-339的抗原提呈细胞刺激小鼠体内的效应性T细胞（Teffs）增殖（P<0.05）；而经过Dex处理而分离出的已结合OVA323-339的抗原提呈细胞（Dex-APC）刺激调节性T细胞（Tregs）增殖（P<0.05）。本实验根据生物信息学新方法预测了热休克蛋白60（HSP60）的T细胞表位抗原肽片段HSP-1和HSP-2，并验证其免疫原性。随后应用MACS技术分离HSP60致敏的效应性T细胞（Teffs）和调节性T细胞（Tregs）并分别与肝脏Kupffer细胞联合培养。结果示Teffs被HSP-1激活时可导致Kupffer细胞活化，包括表面功能标志表达的增强（CD86与MHCII类分子），炎性细胞因子分泌的增加（TNF-和IL-12）；而Tregs被HSP-1激活时可导致Kupffer细胞功能抑制。随后本实验进一步分析接种了以HSP60为靶点的免疫耐受疫苗（即在地塞米松的作用前提下给予HSP-1刺激）的C57BL/6小鼠体内免疫应答情况。结果给予HSP-1再刺激时外周血中， Tregs（CD4+CD25+Foxp3+）占CD4+辅助性T细胞的比率在各组中分别为：NT组（无处理组）1.41±0.09%，Dex组（单用地塞米松组）1.19±0.13%，HSP-1组（单用HSP-1组）1.01±0.11%及TV组（免疫耐受疫苗组）8.76±1.31%；肝脏中的结果为NT7.31±0.69%，Dex9.18±0.72%，HSP-19.87.±0.79%及TV17.96±3.83%。故相比于其他对照组，TV处理组抗原刺激后Tregs比率显著升高（p<0.01）。同时，本实验应用MACS技术将上述各组小鼠脾脏CD4+T细胞分离并用CFSE标记，并给予不同抗原肽刺激，应用流式细胞术检测不同T细胞的增殖情况。结果示在HSP-1的刺激下，Tregs的明显增殖情况出现在TV处理组，其增殖部分细胞比率占CD4+T细胞的26.48±4.32%，相比其他处理组均<8%增殖比率具有显著性差异（p<0.01）。该增殖具有HSP-1特异性，因TV处理组在无关抗原肽MOG的刺激下，增值比率<4%（p<0.01）。本实验为最终观察TV在NASH发病中的作用，给予C57BL/6小鼠预防性接种以HSP60为靶点的免疫耐受疫苗以建立针对HSP60的免疫耐受，然后给予高脂饮食以模拟NASH的发病过程。结果示：1、TV处理组（免疫耐受疫苗组）小鼠肝脏的肝脏指数（肝重/体重100%）为3.64±0.82%，NT组（无处理组）为8.34±1.17%，Dex组（单用地塞米松组）为7.56±0.67%，HSP-1组（单用HSP-1组）为9.08±1.23%。在6个月的高脂饮食下，TV处理组的肝脏指数明显优于其他处理组（p<0.01）。2、TV处理组血清总胆固醇（TC）为118.27±15.18mg/dL，NT组为229.57±21.23mg/dL，Dex组为225.18±16.43mg/dL，HSP-1为304.39±38.32mg/dL。与其他高脂饮食组相比，TV组的血清TC水平显著性降低（p<0.01）。3、TV处理组的血清谷丙转氨酶（ALT）为65.15±11.09IU/L，NT组为157.18±21.26IU/L，Dex组为156.36±15.37IU/L，HSP-1为164.25±14.31IU/L。与其他高脂饮食组相比，TV组的血清ALT水平显著性降低（p<0.01）。4、HOMA-IR的检测结果：TV组为3.72±1.49，NT组为8.49±1.02，Dex组为8.91±0.72，HSP-1为9.61±1.21。与其他高脂饮食组相比，TV组的HOMA-IR水平显著性降低（p<0.01）。5、石蜡切片行HE染色结果为TV组肝小叶结构基本正常，汇管区可见少许炎细胞侵润，少数肝细胞核周围出现小脂肪空泡。而其他高脂饮食组NT、Dex及HSP-1可见肝细胞排列松散，出现弥漫性的肝细胞脂肪变性，遍及整个肝小叶，某些部分可见较大空泡样脂肪变；冰冻切片的脂肪特异性油红O染色结果为相比于TV处理组，NT、Dex及HSP-1组均出现大量肝细胞脂肪变性、细胞肿大、肝索排列紊乱，并且肝脏切片可见广泛、大片的红色脂滴沉着。同时，本研究为了解以HSP60为靶点的免疫耐受疫苗预防性治疗NASH的机理。在高脂饮食过程每2个月检测一次外周血辅助性T细胞的应答变化水平；每个月检测一次血清C反应蛋白（CRP）的浓度。结果示：1、相比于其他对照组，TV组在0-2月其外周血刺激后Tregs（CD4+CD25+FoxP3+）检测得到的比率明显高升高（p<0.01），至第4个月时仍升高（p<0.05）。2、与其他组相比，TV处理组血清C反应蛋白（CRP）在6个月高脂饮食期间持续保持较低水平。本实验发现了地塞米松对体内抗原提呈细胞的功能筛选作用，即保留了相对耐受的Dex-APC，并且发现其具备向调节性T细胞（Tregs）提呈特异性抗原并诱导其增殖的能力，导致抗原特异性免疫耐受。进一步完善和丰富了地塞米松免疫耐受的细胞学机理。随后本实验应用以HSP60为靶点的免疫耐受疫苗预防性治疗非酒精性脂肪性肝炎（NASH）并取得一定疗效，证明了预先建立针对脂类代谢异常所释放新抗原（如HSP60）的调节性T细胞耐受性免疫应答可以缓解NASH的炎症程度。同时，本研究进一步解释了NASH的发病机理，并且免疫耐受疫苗的应用与研究为治疗慢性炎症性疾病提供新的策略。
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标签：非酒精性脂肪性肝炎论文; 免疫耐受疫苗论文; 免疫抑制论文; 调节性细胞论文; 热休克蛋白论文;