论文摘要
前言:急性肺损伤（acute lung injury,ALI）,是呼吸系统疾病中的危重症,其定义是:心源性以外的各种肺内外致病因素引起的急性,进行性缺氧性呼吸衰竭,是肺部炎症和通透性增加的综合征。目前认为,肺内过度性、失控性炎症反应是导致各种病因所致ALl的根本原因。而目前对ALI仍没有确切有效又安全低副作用的药物。随着糖生物学的发展,某些糖类的抗炎生物学功能逐渐被认识。甘露糖这一简单的己糖已被发现具有抗炎作用。甘露糖能抑制伤口愈合时的炎症反应,抑制中性粒细胞的氧化爆发,甘露糖的衍生物对腹膜炎,佐剂性关节炎有抗炎作用。那么甘露糖对炎症过度反应的ALl有无作用?目前国内外未见报道。目的:研究甘露糖对脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）诱导的大鼠急性肺损伤的保护作用;并比较它与另外三种具有相同分子量的己糖（葡萄糖,半乳糖,果糖）对ALI的抗炎效应。方法:雄性SD大鼠,随机分为10组:1.对照组;2.LPS组;3-6.甘露糖不同剂量组（15,45,135,405 mg/kg）;7-9.葡萄糖,半乳糖,果糖（135 mg/kg）组;10.地塞米松（dexameathone,DXM）（2 mg/kg）组。通过气管内滴注LPS（3mg/kg）建立ALI模型,在滴注前5分和滴注后3小时,尾静脉注射各组用药。滴注LPS 6小时后处死动物,行肺湿/干重比,肺渗透指数（pulmonarypermeability index,PPI）,支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid,BALF）中白细胞和中性粒细胞计数,肺和BALF中髓过氧化物酶（myeloperoxidase,MPO）,超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）活性,肿瘤坏死因子（tumornecrosis factor,TNF）-α,白介素（interleukin,IL）-10检测,并观察光学显微镜下肺损伤的程度。结果:1.甘露糖减轻LPS诱导的肺水肿和蛋白渗出LPS组的肺湿/干重比（4.56±0.16）与正常组（4.30±0.18）比较明显升高（P＜0.01）,DXM（阳性对照药）（2 mg/kg）静脉注射明显抑制LPS诱导的肺部水肿（P＜0.05）,静脉注射甘露糖（135,405 mg/kg）减少肺湿/干重比（P＜0.05）:甘露糖405 mg/kg的作用强度相当于DXM 2 mg/kg。半乳糖,葡萄糖和果糖135mg/kg静脉注射不能减轻肺水肿。同时,甘露糖能明显抑制PPI的上升,甘露糖135 mg/kg（4.32±0.45）和405 mg/kg（4.04±0.86）的抑制效应均强于DXM 2 mg/kg（4.37±0.88）,相反,葡萄糖,半乳糖,果糖并无明显的抑制作用。2.甘露糖抑制LPS诱导的肺部炎症细胞侵润气道内滴入LPS引起肺部急性的炎症反应,使BALF中的白细胞数急剧上升。DXM（2 mg/kg）能明显减少LPS诱导的BALF中的白细胞数（P＜0.01）。甘露糖15、45、135和405 mg/kg静脉注射呈剂量依赖性地减少肺部炎症细胞的聚集,使BALF中白细胞数以及中性粒细胞数明显下降。而葡萄糖,半乳糖,果糖135 mg/kg并无明显的抑制作用。甘露糖135 mg/kg与其它三种己糖135mg/kg的效应具有显著性差别（p＜0.05）。3.甘露糖对MPO和SOD活力的影响LPS组肺匀浆中和BALF中MPO水平升高,与对照组比较分别上升了26.3%和9.5%（P＜0.05）。甘露糖剂量依赖性地减少LPS诱导的肺匀浆中和BALF中MPO活性的上升,甘露糖405 mg/kg的抑制强度相当于DXM 2 mg/kg。相反,葡萄糖,半乳糖,果糖组的肺匀浆中和BALF中的MPO均未见降低。同时,LPS组SOD活力下降,而静脉注射甘露糖剂量依赖性地减少LPS诱导的SOD活力下降。静脉给予DXM或其它三种己糖对SOD活力升高均无明显作用。甘露糖135 mg/kg与其它三种同样剂量的己糖的作用具有显著性差异（P＜0.05）。4.甘露糖抑制TNF-α和IL-10的产生LPS组的肺匀浆和BALF中的TNF-α水平显著上升,分别达到对照组的6倍和40倍（P＜0.01）。甘露糖剂量依赖性地减轻LPS诱导的TNF-α的上升,DXM 2mg/kg静脉注射也有明显的抑制作用（p＜0.05）,而葡萄糖,半乳糖,果糖没有明显作用。抗炎因子--IL-10在肺匀浆中的水平于各组中均无显著性差异（数据未显示）。在BALF中,LPS组的IL-10水平升高,甘露糖135 mg/kg组,405 mg/kg组及DXM组的IL-10水平均有明显下降（P＜0.05）。5.甘露糖改善LPS诱导的肺部病理损伤对照组大鼠肺组织HE染色可见肺泡结构完整,肺泡壁无水肿,肺实质无明显炎症细胞浸润,LPS组大鼠肺泡壁明显水肿增厚,肺间质中性粒细胞明显浸润,有出血、水肿及中性粒细胞移行至肺泡腔,肺泡腔内透明膜形成。甘露糖45,135,405 mg/kg和DXM 2 mg/kg减轻了LPS诱导的肺部炎症。低剂量甘露糖（15mg/kg）,以及其它三种己糖并无明显的作用。同时,LPS组肺损伤病理评分（4.8±0.4）比对照组（0.2±0.1）明显增高（P＜0.01）。甘露糖15、45、135和405mg/kg静脉注射呈剂量依赖性降低肺损伤病理评分,其分值分别是:4.6±0.3,3.8±0.4,2.5±0.4,及1.9±0.3。葡萄糖,半乳糖,果糖组与LPS组比较,肺损伤病理评分无显著差异（P＞0.05）。结论:静脉注射甘露糖能降低LPS诱导大鼠急性肺损伤时的肺部毛细血管通透性的增加,减少蛋白渗出及肺水含量,减轻肺组织中PMN浸润程度,抑制肺组织和BALF中TNF-α水平升高,降低肺组织和BALF的MPO水平,提升肺组织SOD活力,并改善肺组织炎症病理变化。而另外三种单糖—葡萄糖,半乳糖和果糖,对LPS诱导的大鼠ALI无明显作用。前言:甘露糖是一个分子量为180.2的简单单糖,我们前一部分的实验已经发现它对LPS诱导的大鼠内毒素性急性肺损伤具有保护作用,它能降低LPS诱导的大鼠急性肺损伤时毛细血管通透性的增加,减少蛋白渗出及肺水含量,减轻肺组织中中性粒细胞（polymorphonuclear neutrophils,PMNs）浸润程度,抑制肺组织和BALF中TNF-α水平升高,降低肺组织和BALF的MPO水平,提升肺组织SOD活力,并改善肺组织炎症病理变化。国外学者也发现甘露糖能抑制伤口愈合时的炎症反应,减少渗出液中中性粒细胞的数量,抑制中性粒细胞的氧化爆发;甘露糖的衍生物,6—磷酸—甘露糖,对腹膜炎,佐剂性关节炎,伤口愈合时的炎症具有抗炎作用。虽然中性粒细胞是炎症中重要的效应细胞,但是巨噬细胞是更为关键的炎症早期时的激动细胞,巨噬细胞释放的炎症因子及其它介质对中性粒细胞的粘附,募集,迁移,活化具有重要意义。在巨噬细胞表面分布有甘露糖受体（mannosereceptor,MR）,其C型凝集素样糖类识别域（C-type lectin-like domain,CTLD）能介导MR与以甘露糖、岩藻糖和N-乙酰氨基葡萄糖为末端的糖类结合。MR对保持内环境稳定,免疫监督（包括识别病原体,激活细胞,递呈抗原）均有作用。是否甘露糖能通过与MR的相互作用影响炎症状态下巨噬细胞的的功能,从而抑制PMN募集与＼活化,减轻炎症反应,目前国际上未见报道。目的:本实验的研究的目的就在于探讨甘露糖对脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）诱导的离体小鼠腹腔和肺泡巨噬细胞炎症反应的影响,并探讨甘露糖受体在其中的作用。方法:采用腹腔灌洗和支气管肺泡灌洗,分别提取小鼠腹腔巨噬细胞及肺泡巨噬细胞。实验使用了两种不同的MR阻断方法:使用甘露聚糖竞争性抑制以及以质粒载体干扰RNA的方法干扰甘露糖受体合成。巨噬细胞均分为:1.对照组:加入等体积培养液;2.LPS组,加入终浓度为1 ug/ml的LPS;3.甘露糖不同剂量组（0.01,0.1,1,10,100mM）:提前5分钟先加入不同剂量甘露糖,随后加入LPS 1 ug/ml;4.甘露聚糖组:在加入LPS前30分钟先加入甘露聚糖2 mg/ml,在加入LPS 1ug/ml前5分钟加入甘露糖1mM;5.SiRNA组:于转染细胞中提前5分钟先加入甘露糖1mM,随后加入LPS 1 ug/ml。加LPS 1.5h后测核因子NF-κB活性,4h后以中性红法检测巨噬细胞吞噬功能,16h后以ELISA法测定巨噬细胞培养上清TNF-α和IL-1β水平,流式细胞术检测细胞的MR表达,RT—PCR测定胞内TNF—α,IL-1β及MR的mRNA水平,Western Blot检测细胞的MR蛋白表达。结果:1.巨噬细胞的pGCsi载体转染:pGCsi载体转染小鼠腹腔或肺泡巨噬细胞48h后,荧光镜下可得Mrc1-3质粒的转染效率分别为40.5%和43.7%;RT—PCR测定MR的mRNA表达量分别为未转染组细胞的54.0和56.1%;Western-blot分析提示pGCsi载体转染后的腹腔或肺泡巨噬细胞的MR的蛋白显著减少;流式细胞术检测提示转染质粒组MR表达阳性细胞百分率分别下降为对照组的56.1%和59.7%。结果表明,转染Mrc1-3质粒能明显抑制腹腔或肺泡巨噬细胞的甘露糖受体的表达,证明载体质粒干扰MR的表达成功。2.LPS激发巨噬细胞炎症并下调MR表达:小鼠的腹腔或肺泡巨噬细胞以1ug/ml的LPS刺激,4h后吞噬功能明显增强,光镜下观察胞内中性红颗粒增多增浓,摄取中性红的吸光度(OD540)值显著上升;LPS 1 ug/ml共育16h后引起腹腔或肺泡巨噬细胞细胞上清液中前炎症因子TNF-α和IL—1β的8～44倍的剧烈上升;胞内TNF-α和IL-1β的mRNA表达水平显著增加,提示腹腔或肺泡巨噬细胞在LPS作用下引发了炎症性的吞噬和分泌功能的变化。同时,LPS 1 ug/ml共育16h后对腹腔或肺泡巨噬细胞的MR表达有下调作用,表现为流式细胞术检测发现巨噬细胞表面MR的表达分别比正常对照组下降了31.2%和17.4%;WesternBlot检测提示巨噬细胞MR的蛋白表达水平有明显的下调;RT-PCR检测发现巨噬细胞表达甘露糖受体mRNA的量下降,分别约为正常对照组的67.3%和66.2%。3.甘露糖拮抗LPS诱导的巨噬细胞炎症并上调MR:在小鼠的腹腔或肺泡巨噬细胞中,甘露糖0,0.01,0.1,1,10,100mM呈剂量依赖性减少LPS诱导的小鼠腹腔或肺泡巨噬细胞的炎症反应,表现为抑制腹腔或肺泡巨噬细胞吞噬功能,甘露糖1 mM组的吸光度分别比LPS组的吸光度下降了24.2%和11.8%;抑制腹腔或肺泡巨噬细胞炎症因子TNF-α和IL-1β释放,甘露糖1,10,100 mM组与LPS组相比有非常显著的差异;甘露糖（0.1,1,10 mM）剂量依赖性地抑制腹腔或肺泡巨噬细胞的TNF-α和IL-1β的mRNA表达,甘露糖10 mM使腹腔巨噬细胞的TNF-α和IL-1βmRNA降为LPS组的66.4%和58.2%,使肺泡巨噬细胞的TNF-α和IL-1βmRNA降为LPS组的61.8%和61.3%。甘露糖在抑制巨噬细胞炎症的同时,上调了巨噬细胞表面MR的表达。我们以抗甘露糖受体抗体作流式细胞分析,以Western Blot检测巨噬细胞MR的蛋白表达,以RT-PCR测定胞内MR的mRNA表达水平,均发现预先加入不同浓度（0.1,1,10 mM）的甘露糖,与LPS组相比,能剂量依赖性地上调巨噬细胞的MR表达水平。4.阻断MR,能阻断甘露糖的抗炎效应:使用甘露聚糖2 mg/ml竞争性抑制或者以质粒载体干扰RNA的方法干扰甘露糖受体后,再给予甘露糖1mM,则明显抑制了甘露糖1mM原有的抗炎效应,表现为:对LPS诱导的增强中性红吞噬作用无明显抑制;不能减少LPS诱导的培养上清中增多的炎症因子TNF-α和IL-1β;巨噬细胞胞内TNF-α和IL—1βmRNA表达水平仍维持在高水平。同时,流式细胞术,RT-PCR,Western Blot的检测显示,在预先加入甘露聚糖2mg/ml或者预先以pGCsi载体转染后的巨噬细胞中再给予甘露糖1mM,不能提升MR的mRNA的表达水平和蛋白表达水平,相反,在LPS或者LPS和RNA干扰的双重作用下,这两组的MR有不同程度的下调,其中载体转染组的甘露糖受体表达水平为最低。5.甘露糖抑制LPS所诱导的巨噬细胞核内NF-κb/p65的表达:Western Blot检测显示,在正常腹腔或肺泡巨噬细胞核蛋白中有低水平的NF-κb/p65表达,经LPS 1 ug/ml刺激1.5h后核内NF-κb/p65表达明显增高,分别达到正常对照组的2.4和4.5倍。预先给予甘露糖（0.1,1,10 mM）,能剂量依赖性地抑制LPS所诱导的核内NF-κb/p65高水平表达。而以甘露聚糖2mg/ml预处理,或者预先以pGCsi载体转染后的腹腔或肺泡巨噬细胞,再给予甘露糖1mM共育1.5h,则不能阻止LPS诱导的核内NF-κb/p65表达上调。结论:（1）甘露糖能抑制LPS诱导的小鼠腹腔和肺泡巨噬细胞炎症反应,抑制LPS诱导的巨噬细胞吞噬功能的增强,抑制巨噬细胞炎症因子TNF-α和IL-1βmRNA的合成和炎症因子蛋白在上清中的释放:（2）LPS对小鼠腹腔和肺泡巨噬细胞的MR有下调作用,甘露糖在发挥抗炎效应的同时对MR有上调作用;（3）以特异的MR自然配体——甘露聚糖竞争性抑制MR或以转染脂质体干扰MR的合成后,能够阻断甘露糖的抗炎效应,表明甘露糖的抗炎效应至少部分是通过MR实现的。（4）甘露糖能抑制LPS诱导的巨噬细胞的核因子NF-κB的活性,提示甘露糖可能通过NF-κB信号通路,进而在mRNA水平上抑制LPS所致的腹腔或肺泡巨噬细胞TNF-α、IL-1β的表达。
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