蝴蝶兰花序分生组织基因LFY表达载体构建及对蝴蝶兰的遗传转化

论文摘要

LFY是花分生组织特性基因（floral meristem identity gene）,广泛表达于植物的营养器官和生殖器官。LFY与调控植物开花时间的基因密切相关,调控开花时间的四条途径均表达于LFY基因的上游且在LFY基因处整合,LFY在花诱导后表达水平加强。通过对模式植物拟南芥LFY基因研究的深入,发现LFY基因是一个控制花序梢分生组织特征的基因,LFY参与促进花分生组织的形成和花分生组织属性的控制,参与维持花分生组织的正常功能、花启动、防止花分生组织的逆转。在花分生组织属性基因中LFY基因是首先表达的。LFY编码了一个发育开关,其活性足以将所有侧梢转变成单花芽,从而诱导植株提早开花。植物LFY基因表达量只有达到一定值时才能成花,同时其过量表达不影响花模式且能提前成花。生物技术的迅速发展启发人们用转基因的手段研究应用LFY基因,在转LFY基因杨树、烟草、菊花和水稻等植物中,LFY的超量表达均使花期提前。本实验在吸取前人经验的基础上,构建了适合植物的表达载体pRI101-LFY,并将其转化进入根癌农杆菌EHA105中,通过农杆菌介导法将LFY基因转入蝴蝶兰中,然后对转基因植株进行检测,借以初步探讨LFY基因在蝴蝶兰中的转化和表达情况,使LFY基因能够超量表达,从而获得能提前开花的蝴蝶兰品种。实验结果如下:（1）蝴蝶兰LFY基因的获取及克隆根据ncbi中已报道的蝴蝶兰LFY基因序列,运用RT-PCR法扩增出LFY基因,连接至克隆载体pMD19-T后转化E.coli DH5α,通过质粒PCR、双酶切、测序鉴定,得到重组质粒pMD19-T-LFY。（2）蝴蝶兰LFY基因植物表达载体pRI101-LFY的构建与鉴定利用DNA重组技术,将蝴蝶兰LFY基因克隆至植物表达载体pRI101中后转化E.coli DH5α,通过质粒PCR、双酶切、电泳鉴定证明蝴蝶兰LFY基因植物表达质粒pRI101-LFY成功构建。（3）pRI101-LFY质粒转化根癌农杆菌将重组质粒pRI101-LFY通过直接转化法导入根癌农杆菌EHA105中,用利福平（Rif）和卡那霉素（Kana）进行筛选得到阳性克隆,通过质粒PCR,双酶切鉴定证明重组质粒成功转化根癌农杆菌EHA105。（4）蝴蝶兰再生体系的建立采用无菌蝴蝶兰原球茎为外植体,以MS为基本培养基,筛选出播种培养基:1/4 MS+KT 0.5mg/l+AC 1g/l+蛋白胨1g/l+椰汁50%,成苗培养基:1/2 MS+NAA 5mg/l + IBA 5m g/l+AC 0.5%+土豆50g/l,分化培养基:1/2 MS +6-BA 10mg/L+椰汁20g/l,生根培养基:1/2 MS + 6-BA 0.3mg/l。（5）转化体筛选及植株再生将预培养3-4天的原球茎与农杆菌菌液浸染5-15分钟后,共培养2-3天,然后转化到含MLPN和Kana的选择培养基上进行分化筛选,转入外源基因的原球茎将会在这一系列筛选过程中发芽、生根,获得转基因植株。（6）转基因蝴蝶兰植株的PCR检测提取转基因蝴蝶兰植株基因组DNA后,PCR扩增蝴蝶兰LFY基因,证明LFY基因已导入蝴蝶兰中,转化率为25%。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• 1 文献综述
• 1.1 植物成花分子机理研究综述
• 1.2 植物成花分子机理研究进展
• 1.2.1 光周期影响植物成花分子机理
• 1.2.2 春化作用影响植物成花分子机理
• 1.2.3 基因调控植物成花分子机理
• 1.3 LFY 基因
• 1.3.1 LFY 基因研究进展
• 1.3.2 LFY 基因研究现状
• 2 引言
• 3 材料和方法
• 3.1 LFY 基因的设计与获取
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 实验方法
• 3.2 蝴蝶兰LFY 基因的克隆
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 试验方法
• 3.3 蝴蝶兰LFY 植物表达载体的构建及农杆菌转化
• 3.3.1 实验材料
• 3.3.2 试验方法
• 3.4 重组农杆菌E-pRI-LFY 对蝴蝶兰的遗传转化
• 3.4.1 实验材料
• 3.4.2 试验方法
• 4 结果分析
• 4.1 蝴蝶兰 LFY 基因的获取与检测
• 4.1.1 蝴蝶兰总RNA 检测
• 4.1.2 蝴蝶兰LFY 基因的合成
• 4.2 重组质粒pMD19-T LFY 的检测与序列分析
• 4.2.1 重组质粒pMD19-T LFY 的PCR 检测
• 4.2.2 重组质粒pMD19-T LFY 双酶切鉴定
• 4.2.3 重组质粒pMD19-T LFY 序列分析
• 4.3 蝴蝶兰植物表达质粒 pRI101-LFY 的鉴定
• 4.3.1 表达载体pR1101 的构建
• 4.3.2 重组表达质粒pR1101-LFY 双酶切鉴定
• 4.4 重组农杆菌的鉴定
• 4.5 重组农杆菌E-pRI-LFY 转化蝴蝶兰检测
• 4.5.1 蝴蝶兰组织快繁体系建立
• 4.5.2 抗性植株Kana 筛选压力的确定
• 4.5.3 侵染时间对转化的影响
• 4.5.4 乙酰丁香酮对农杆菌转化的影响
• 4.5.5 美罗培南对重组农杆菌侵染蝴蝶兰原球茎的影响
• 4.5.6 蝴蝶兰抗性植株的检测
• 5 结论与讨论
• 5.1 蝴蝶兰 LFY 基因的获取
• 5.2 植物表达载体 pRI101-LFY 的构建
• 5.3 农杆菌介导法转化蝴蝶兰
• 5.4 PCR 检测
• 参考文献
• 英文摘要