马传染性贫血病毒LTR嵌合克隆生物学特性的研究

论文题目: 马传染性贫血病毒LTR嵌合克隆生物学特性的研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 预防兽医学

作者: 魏丽丽

导师: 李景鹏,沈荣显

关键词: 马传染性贫血病毒,长末端重复,感染性分子克隆,衍生病毒

文献来源: 东北农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 马传染性贫血病毒(Equine infectious anemia virus, EIAV)是反转录病毒科慢病毒属成员之一,在基因组结构和抗原性上与人艾滋病病毒(Human immunodeficiency virus, HIV)十分相似,可以引起马属动物的一种急性烈性传染病,以贫血、持续感染、反复发热为特征,终生持续感染,是马属动物最重要的传染病之一。二十世纪七十年代沈荣显等通过体外细胞传代致弱路线研制成功了马传贫驴白细胞弱毒疫苗,并以此成功控制了马传贫在中国的流行,是迄今为止世界上唯一大规模应用的慢病毒疫苗。该疫苗具有良好的安全性和有效性,成为研究包括艾滋病毒在内的慢病毒疫苗的良好模型。马传贫弱毒疫苗致弱路线是:将一株来源于马体的EIAV 超强毒力的辽毒株(LN)经过驴体连续传代100 余代使病毒毒力增强后获得了驴强毒株(DV)(对马和驴均100%致死),然后将DV 株连续通过驴白细胞进行体外培养驯化,使其病毒毒力完全丧失,而保持了良好的免疫原性,最终培育成功EIAV 驴白细胞弱毒疫苗(DLA)(沈荣显等,1979),DLA进一步通过驴胎皮肤细胞培养驯化,又获得了皮肤细胞弱毒疫苗株(FD)。为了揭示我国马传贫弱毒疫苗毒力致弱及免疫保护的分子机制,为人免疫缺陷病毒及其它慢病毒的免疫预防提供借鉴,利用我国拥有的马传染性贫血病毒疫苗培育系统(由强毒到弱毒的不同代次病毒),对EIAV 弱毒疫苗致弱过程中EIAV 非编码区LTR 进行了序列分析,将病毒致弱的基因变异位点锁定在有限范围之内。本试验基于代次毒分析结果,选取LTR 变异率较高的U3 区,以驴胎皮肤弱毒疫苗感染性分子克隆株pLGFD3-8 和驴强毒株感染性分子克隆株为父本操作系统进行基因替换,构建EIAV 非编码区强弱毒嵌合的全基因分子克隆,将阳性重组质粒命名为pLGFD9-12。将该嵌合克隆体外转染驴胎皮肤细胞(FDD)并以驴白细胞(DL)传代,通过逆转录酶活性试验、前病毒DNA PCR 扩增、RT-PCR 方法及实时定量RT-PCR 等试验验证其转染结果。结果显示,LTR 嵌合克隆衍生病毒感染FDD 和DL 细胞均出现明显的细胞病变,电镜下可见大量典型的EIAV 颗粒,将其病毒命名为vLGFD9-12;细胞培养上清可检测到RT 酶活性;前病毒DNA PCR 扩增和RT-PCR 均为阳性。在细胞水平上对该嵌合克隆衍生毒及其亲本感染性分子克隆毒株复制能力进行了检测,发现此嵌合克隆衍生病毒与其父本克隆衍生病毒具有相似的复制水平,此嵌合克隆衍生病毒在DL 细胞上复制水平略高于FDD 细胞,保持了亲本皮肤弱毒疫苗感染分子克隆的复制特点和细胞嗜性。同时也说明E-box 基序和GATA 基序的改变并没有引起LTR 对病毒复制和细胞嗜性的影响。将5 匹EIAV 阴性健康马分为3 组,第1 组(2#马)作为非接种健康对照组,第2 组(15#和17#马)接种驴胎皮肤弱毒疫苗感染性分子克隆衍生毒pLGFD3-8,第3 组(20#和30#马)接种LTR 嵌合克隆衍生毒vLGFD9-12。接种剂量均为每匹马5ml×105TCID50,接种途径均为皮下。接种后,每日观察试验动物体温和临床症状、定期采集试验动物肝素抗凝外周血,分析其血液学变化、病毒在接种动物外周血中的拷贝数水平及不同时间诱导动物体特异性淋巴细胞增殖水平、特异性细胞毒性T 淋巴细胞杀伤反应,明确LTR 与毒力的相关性及该嵌合克隆毒株与其父本弱毒疫苗株在马体复制和分布的情况。在150 天观察期内,各组试验动物均未见体温升高,仅15#马在第47 天有一次短暂的一过性发热,达39.1℃,但为一过性发热。

论文目录:

摘要

ABSTRACT

1 前言

1.1 马传染性贫血病毒概述

1.1.1 EIAV 认知历史和现状

1.1.2 EIAV 形态结构和理化特性

1.1.3 EIAV 的生物学特性

1.1.4 EIAV 的致病性

1.2 马传染性贫血病毒的分子生物学

1.2.1 EIAV 基因组结构

1.2.2 EIAV 的基因及其编码蛋白

1.3 EIAV 基因非编码区LTR 相关研究进展

1.3.1 EIAV LTR 的结构和生物学功能

1.3.2 LTR 增强子区与细胞嗜性密切相关

1.3.3 LTR 存在特异性转录因子基序与病毒致病性密切相关

1.3.4 LTR 转录因子基序及其变异对病毒复制的影响

1.3.5 LTR 在中国EIAV 弱毒疫苗致弱过程中的变化

1.3.6 LTR 在反向遗传学中的应用

1.4 本研究背景、内容和意义

2 材料和方法

2.1 材料

2.1.1 病毒和细胞

2.1.2 质粒和菌株

2.1.3 引物

2.1.4 试剂

2.1.5 培养基

2.1.6 主要仪器

2.2 方法

2.2.1 细胞培养

2.2.2 EIAV LTR 强弱毒嵌合病毒的构建

2.2.3 质粒的提取和纯化

2.2.4 质粒在细胞培养中的转染和传代

2.2.5 转染传代后细胞培养物中EIAV 的检查

2.2.6 嵌合病毒复制动力学分析

2.2.7 动物感染试验

3 结果

3.1 EIAV LTR 强弱毒嵌合克隆的构建

3.2 转染及感染性

3.3 嵌合病毒复制动力学分析

3.4 动物感染性试验

4 讨论

4.1 替换区域的选择及其生物学意义

4.2 感染性克隆的构建

4.3 EIAV LTR 嵌合克隆构建的意义

4.4 EIAV LTR 嵌合克隆复制特性和细胞嗜性

4.5 LTR 对病毒毒力的影响

4.6 马淋巴细胞增殖功能及细胞毒性T 淋巴细胞杀伤功能检测方法的建立

4.7 EIAV 免疫保护反应

5 结论

致谢

参考文献

攻读博士期间发表的学术论文

作者简介

发布时间: 2005-10-31

参考文献

• [1].马传染性贫血病毒弱毒疫苗致弱过程中env基因的变异及LTR的作用[D]. 涂亚斌.中国农业科学院2005
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