论文摘要
成纤维细胞生长因子受体（fibroblast growth factor receptors, FGFRs）属于受体酪氨酸蛋白激酶（receptor tyrosine kinase, RTK）家族,它们通过与成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor, FGFs）结合发挥生物学功能。FGFs/FGFRs作用广泛,近年来大量研究发现FGF信号与骨骼发育及疾病也有密切关系。骨骼形成主要通过软骨内成骨和膜内成骨两种方式来完成。其中骨组织形成的基本过程一致,即间充质干细胞增殖和密集后分化为成骨细胞,成骨细胞分泌类骨质,并被包埋其中,成为骨细胞,继而类骨质钙化成骨基质,最后形成骨组织。在成年期,骨骼正常结构和功能的维持主要通过骨重建（remodeling）来实现。FGFR3是FGFRs家族成员之一,它是骨骼生长的负性调节分子。在人体中FGFR3的功能增强型点突变主要引起软骨发育不全（achondroplasia, ACH）、季肋发育不全（hypochondroplasia, HCH）和致死性骨发育不全（thanatophoric dysplasia, TD）等三种软骨发育不良性疾病。既往对FGFR3在软骨发育中的作用研究较多,但对其在骨形成,特别是成年期骨重建中的作用和相关机制缺乏深入的了解和分析。人类FGFR3 A391E等功能增强型点突变可引起囟门早闭,提示FGFR3对骨形成可能有直接调节作用。成年期FGFR3敲除小鼠骨质减少,矿化缺陷,进一步提示FGFR3可调节成骨并能影响成年期骨重建,但具体机制不明。此外,模拟人类软骨发育不全的FGFR3功能增强型点突变小鼠除软骨发育异常外,出生早期生长板处即有Cbfa1、OP和OC等成骨标志基因表达上调,并伴有骨领提前发生和骨小梁短少,这时有关骨形成的变化和早期软骨形成障碍还有一定的联系,但其成年后骨骼是否还有改变尚不清楚,需要进一步研究。骨折愈合过程是骨骼局部的再发育过程,很多调节骨骼发育的分子也都调节骨折愈合过程。大量研究表明FGFs参与骨折愈合,而FGFs又通过FGFRs发挥作用。如前所述,FGFR3是体内重要的调节骨骼发育的分子,提示它可能参与调节骨折愈合过程,但它对骨折愈合的具体作用和机制有待进一步阐明。据此,本课题利用野生型和FGFR3功能增强型点突变（FGFR3G369C/+）小鼠（模拟人ACH疾病）,从影响骨重建和骨折愈合的多种因素入手,探讨了FGFR3在成年期骨重建和骨折愈合中的作用和机制。主要实验方法:第一部分:FGFR3在小鼠成年期骨重建中的作用和机制研究1、利用X线摄片、双能骨密度计和Micro CT观察成年小鼠股骨骨密度及骨组织结构的变化。用三点折断法检测其生物力学特性。2、通过HE、Masson三色染色和钙绿素双标实验观察小鼠胫骨骨小梁的结构及矿化情况。测定血清钙磷含量,了解体内钙磷代谢是否与骨骼矿化有关。定量PCR检测成骨细胞分化标志基因OC、OP和成骨相关基因FGFR1、FGFR2和BMPR1A的表达。3、小鼠骨髓基质细胞分离培养,测定生长曲线并进行成骨诱导。通过碱性磷酸酶、茜素红染色观察,结合成骨相关基因的表达,观察成骨分化和矿化情况,并用Western Blot检测其Erk1/2磷酸化水平。4、通过TRAP染色观察胫骨破骨细胞形成情况,定量PCR检测破骨细胞相关基因TRAP、Ctsk和MMP9的表达变化。5、体外进行破骨细胞诱导分化,通过TRAP染色、骨吸收实验和破骨细胞相关基因表达的检测,研究破骨细胞的分化及骨吸收功能。Western Blot检测破骨细胞中Erk1/2磷酸化水平。第二部分:FGFR3在小鼠骨折愈合中的作用和机制研究1、用原位杂交方法检测FGFR3 mRNA在骨折愈合各阶段骨痂中的表达。2、利用X线摄片和藏红固绿染色观察骨折愈合情况。生物力学实验检测骨折21天后胫骨的机械性能。3、利用原位杂交和藏红固绿染色,结合骨痂中软骨细胞分化相关基因COL2A1、COL10A1、IHH和SOX9的mRNA变化观察软骨分化情况。通过体外骨髓基质细胞向软骨细胞诱导分化实验进一步验证上述在体实验的结果。4、通过骨痂组织TRAP染色,结合TRAP mRNA表达检测,观察破骨细胞形成情况。主要实验结果:一、FGFR3G369C/+小鼠成年期骨量减少,骨重建异常1、FGFR3G369C/+小鼠成年后骨量减少,骨皮质生物力学性能改变2月和4月龄的FGFR3G369C/+小鼠股骨骨密度降低,骨小梁数量减少,分离度降低;骨皮质厚度无明显改变,但反映其生物力学特性的最大值弯曲载荷和弹性模量均增加。2、FGFR3G369C/+小鼠成骨细胞分化增强、矿化降低（1） 2月龄FGFR3G369C/+小鼠胫骨骨小梁稀疏。骨小梁表面成骨细胞胞体增大,伴有类骨质增多,矿物质沉积率降低,提示该小鼠成骨细胞虽然分泌基质的功能活跃,但胞外基质矿化能力可能存在缺陷,而体内血清钙磷含量正常,提示骨骼矿化障碍是由成骨细胞本身功能异常引起的。骨组织中成骨细胞分化标志基因OP表达增加;成骨相关基因FGFR1和BMPR1A表达上调,FGFR2表达下降。（2） FGFR3G369C/+小鼠骨髓基质细胞增生减慢,向成骨细胞分化过程中碱性磷酸酶表达增加,钙结节形成减少,成骨细胞分化标志基因Cbfa1、OP和OC表达均显著上调,表明成骨细胞分化增强,矿化降低。此外,FGFR3G369C/+小鼠骨髓基质细胞中Erk1/2磷酸化蛋白水平明显增加,提示FGFR3G369C/+小鼠成骨和矿化能力的改变可能是由Erk1/2信号途径活化引起的。3、FGFR3G369C/+小鼠破骨细胞分化和骨吸收功能增加（1） FGFR3G369C/+小鼠胫骨生长板处破骨细胞数量增加,骨小梁表面吸收陷窝变深;骨组织中破骨细胞功能相关基因TRAP和Ctsk表达明显增加,MMP9则无改变。结果提示FGFR3G369C/+小鼠破骨细胞形成和骨吸收功能增加。（2） FGFR3G369C/+小鼠体外诱导的破骨细胞形成数量及骨片上吸收陷窝面积都明显增加,破骨细胞功能相关基因TRAP和MMP9表达显著上调,Ctsk表达没有改变。破骨细胞Erk1/2蛋白磷酸化水平升高,提示FGFR3可能通过激活Erk1/2通路促进了破骨细胞形成和骨吸收功能。二、FGFR3G369C/+小鼠骨折愈合延迟1. FGFR3在骨折后7天、14天和21天骨痂的增生、肥大前和肥大软骨细胞中都表达,提示FGFR3可能参与调节骨折愈合过程。2. FGFR3G369C/+小鼠胫骨骨折后21天,骨痂中仍有软骨残留,并且其最大值弯曲载荷减少,说明该小鼠骨折愈合延迟,并且骨折后胫骨的机械性能下降。3. FGFR3G369C/+小鼠骨痂软骨细胞分化降低（1） FGFR3G369C/+小鼠骨痂处增生软骨细胞标志基因COL2A1和肥大软骨细胞标志基因COL10A1分别在骨折后3天和7天时表达滞后或下降;骨折后10和14天,FGFR3G369C/+小鼠骨痂中肥大软骨细胞较少,但增生软骨细胞和不成熟的间充质细胞较多;软骨分化相关基因SOX9和IHH表达降低。结果提示FGFR3G369C/+小鼠骨痂软骨细胞分化受到抑制。（2） FGFR3G369C/+小鼠骨髓基质细胞向软骨分化过程中COL2A1和SOX9表达下降,提示体外软骨细胞分化减慢。4、FGFR3G369C/+小鼠骨痂破骨细胞形成异常骨折后10天和14天,FGFR3G369C/+小鼠骨痂破骨细胞形成明显减少,但骨折后21天破骨细胞形成增加。主要结论:1、FGFR3功能增强点突变小鼠成年期骨量下降由其成骨作用改变及破骨细胞功能增强共同引起。2、FGFR3功能增强抑制骨髓基质细胞增生;促进Cbfa1表达,继而上调OP和OC表达水平促进其向成骨细胞分化,抑制矿化。这一作用可能部分是通过激活Erk1/2信号通路实现的。3、FGFR3功能增强后可能通过激活破骨细胞中Erk1/2信号通路,上调TRAP和Ctsk表达水平,从而促进破骨细胞分化及骨吸收功能。4、FGFR3功能增强后抑制骨痂软骨细胞分化,同时使破骨细胞骨吸收功能继发性受抑制,这两种因素共同作用导致骨折愈合延迟。