丙戊酸钠诱导t（8；21）急性白血病分化凋亡机制的研究

论文摘要

目的:t（8,21）急性白血病关键的发病机制与染色体易位产生的AML1-ETO的融合蛋白异常募集组蛋白脱乙酰化酶（HDAC）抑制AML1靶基因的转录有关。本研究探讨HDAC抑制剂丙戊酸钠（valproic acid,VPA）是否能阻断AML1-ETO融合蛋白的生物学功能,从而达到消除HDAC对AML1靶基因的转录抑制,诱导t（8,21）急性白血病细胞分化、凋亡和对其生长抑制作用。材料和方法:VPA处理t（8,21）急性白血病细胞株Kasumi-l细胞,应用台盼蓝拒染法观察VPA对细胞的生长作用的影响、普通光学显微镜观察细胞形态改变、流式细胞术分析细胞周期和检测髓系分化抗原的表达、DNA凝胶电泳分析细胞的凋亡、RT-PCR方法检测AML1的调控基因及凋亡相关基因表达水平变化。结果:1. VPA抑制Kasumi-l细胞的生长不同浓度VPA处理Kasumi-1细胞24、48及72h后Kasumi-1细胞的生长明显受抑,并且这种抑制作用呈剂量依赖性和时间依赖性。VPA处理Kasumi-1细胞3天时的半数抑制浓度（IC50）为2.33mmol/L。2. VPA诱导Kasumi-1细胞分化Kasumi-1细胞经VPA处理24、48、72及96h后用流式细胞术分析表达于较成熟的粒细胞和单核细胞的髓系标志CD11b。结果显示,随着处理时间的延长和剂量的增加,Kasumi-1细胞表达CD11b的比率也逐渐增加。3mmol/L VPA处理Kasumi-1细胞3天后,其CD11b的表达比率由4.7%上升至90.6%（P<0.05）,但是当VPA浓度超过3mM或进一步延长培养时间,Kasumi-1细胞死亡数明显增多,CD11b抗原的表达反而下降。瑞氏染色普通光学显微镜下观察发现,Kasumi-1细胞经3mM VPA处理24小时后即能发生细胞形态变化,表现为细胞核浆比例减少、核仁消失、肾型核增多等分化表现;随着培养时间的延长,细胞形态的变化（核浆比例减少）更加明显,肾型核细胞数增多,但未出现杆状核、分叶核细胞等终末分化的变化。3. VPA诱导Kasumi-1细胞凋亡经DNA凝胶电泳分析,Kasumi-l细胞经VPA 3mM处理3天时,出现典型的凋亡细胞所具有的梯形DNA条带。瑞氏染色普通光学显微镜下观察发现,3mmol/L VPA处理Kasumi-l细胞5天后,大部分细胞出现体积变小、核固缩、染色质聚集、凋亡小体等明显细胞凋亡的形态学改变。4. VPA对Kasumi-1细胞周期的影响VPA处理的Kaumi-细胞经流式细胞仪分析细胞周期的改变,结果发现随着VPA药物浓度的增加和处理时间的延长,G0/G1期细胞比率逐渐增加。3mmol/LVPA处理Kasumi-1细胞3天时,G0/G1期细胞比率由50.1%上升至80.7%(P<0.01〕,S期和G2/M期细胞比率同时减少。5.VPA对粒单刺激因子（GM-CSF）表达的影响半定量RT-PCR分析（见图11、13）表明VPA诱导Kasumi-l细胞AML1蛋白的下游调控基因GM-CSF的mRNA表达明显增加,且这种作用呈剂量依赖性和时间依赖性。3mmol/L VPA处理Kaumi-细胞5天,与对照组相比mRNA表达明显增加(P〈0.01〉。6.VPA对Caspase 7表达的影响半定量RT-PCR分析Caspase 7mRNA表达水平表明,随着VPA处理时间的延长Caspase 7 mRNA表达水平明显增加。3mmol/L VPA处理Kasumi-1细胞3天(P ?0.05〉及5天(P ?0.01〉后Caspase 7 mRNA表达水平均明显高于空白对照组。应用不同浓度的VPA（1Mm,2mM,3mM）处理Kasumi-1细胞后,Caspase7mRNA表达水平也随着浓度的增加呈现增加的趋势,但统计学差异不显著。结论:HDAC抑制剂VPA能通过抑制HDAC的活性,消除AML1-ETO融合蛋白的转录抑制作用,促使AML1调控基因表达增加,能够抑制t（8,21）急性白血病细胞株Kasumi-1细胞的生长,并使细胞阻滞于G0/G1期;诱导Kasumi-1细胞分化及凋亡。VPA诱导Kasumi-1细胞的凋亡可能是经过Caspase依赖的凋亡途径完成。该研究为应用VPA临床治疗急性白血病提供了理论基础,对t（8,21）急性白血病分子学发病机制有进一步的认识。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
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• 研究论文 丙戊酸钠诱导t（8;21）急性白血病分化凋亡研究
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附图表
• 文献综述 丙戊酸钠的抗肿瘤作用
• 致谢
• 个人简历