论文摘要
癌症已成为威胁人类健康的三大杀手之一，许多研究已经证实，肿瘤侵袭转移才是恶性肿瘤治疗失败和预后不良的罪魁祸首，而其复杂的转移过程与细胞骨架异常重组密切相关。食管癌是常见恶性肿瘤之一，但其转移机制尚不明了。Fascin蛋白是一种细胞骨架成束蛋白，可与丝状肌动蛋白（F-actin）结合而影响细胞粘附和运动。以往的研究发现，fascin基因在许多上皮来源的肿瘤细胞系均表达上调。汕头大学医学院以往的研究发现，Fascin蛋白在恶性食管癌细胞中呈现过表达，Fascin不仅参与了肿瘤细胞的分裂增殖，而且还与肿瘤细胞的侵袭、移动和粘附等生物学行为密切相关，是一种重要的癌转移标志物。然而到目前为止，关于其在肿瘤细胞中上调表达的分子机制尚不清楚。基于此，本文从食管癌细胞系ECl09全基因组DNA中扩增fascin基因5′侧翼系列缺失片段，构建了系列萤火虫荧光素酶报告基因表达载体，经转染食管癌细胞EC109，应用双荧光素酶报告基因检测系统对所转染细胞内荧光素酶表达活性进行分析，以初步鉴定食管癌细胞中fascin基因核心启动子区所在位置，并鉴定出在食管癌细胞fascin转录调控中发挥作用的关键调控元件，进而为从分子水平阐明fascin在食管癌细胞中上调表达的机制打下一定的基础，也为以转录因子为靶向进行肿瘤基因治疗提供了可能性。研究内容：1、提取食管癌细胞系EC109全基因组DNA，以其为模板，设计引物，扩增fascin基因5′侧翼区约3kb片段，连入T载体，构建pTF-2900（设转录起始位点为+1，-2900表示插入外源片段位于转录起始位点上游2900bp处，命名方式下同），测序。2、以pTF-2900为模板，PCR分段扩增fascin基因5′侧翼区依次截短约500bp的四条片断，亦连入T载体，测序。3、将上述五个扩增片段经DNA重组克隆至pGL3-Basic Vector（pGLB）中，构建萤火虫荧光素酶报告基因表达载体pBF-2900～-436，测序。4、将上述所构建五个重组质粒pBF-2900～-436和对照质粒pGLB、内参照质粒pRL-TK一同瞬时转染EC109细胞，培养48小时后裂解细胞进行双荧光素酶报告基因检测。5、以pBF-1435为模板进行嵌套缺失试验，获得系列缺失子，测序。将测序结果正确的缺失子和对照质粒pGLB、内参照质粒pRL-TK一同瞬时转染EC109细胞，培养48小时后裂解细胞进行双荧光素酶报告基因检测。6、生物信息学预测转录起始位点上游387bp区段内存在哪些潜在的转录调控元件。7、以pBF-387为模板，用PCR及酶切的方法构建元件（SP1、CREB、TATAbox）缺失表达载体，测序。8、以空载体pGLB为对照，将测序结果正确的重组质粒与内参照质粒pRL-TK一同瞬时转染EC109细胞，培养48小时后裂解细胞进行双荧光素酶报告基因检测，结果分析。结果和结论：1、以食管癌细胞系EC109全基因组DNA为模板，成功扩增出fascin基因5′侧翼区3kb片段，测序结果与GenBank中注册的人fascin基因经NCBI／BLAST比对，证明确为fascin基因，除四个碱基不同外，相似度达到99.9％。2、以pTF-2900为模板PCR分段扩增fascin基因5′侧翼区依次截短约500bp的四条片断，测序结果经NCBI／BLAST，证明扩增结果正确，与预期扩增长度吻合。3、成功构建萤火虫荧光素酶报告基因表达载体pBF-2900～-436。4、双荧光素酶报告基因检测系统检测pBF-2900～436在EC109细胞中启动荧光素酶表达活性，结果表明fascin基因在EC109细胞中确有显著的启动子活性，且启动子区至少位于转录起始位点上游436bp内。5、通过嵌套缺失所得缺失子测序，表明成功获取系列缺失子质粒pBF-1435～+82。6、双荧光素酶报告基因检测系统检测系列缺失子在EC109细胞中启动荧光素酶表达活性，结果分析确定fascin基因核心启动子区位于转录起始位点上游316bp到22bp的区段内。7、应用转录因子数据库软件AliBaba2．1分析预测fascin 5’侧翼-387区段内潜在的转录因子结合位点，总共发现56个转录因子，其中包含多个SP1结合位点，在靠近TATA框处存在一段DNA序列，可同时结合CREB、C／EBP alpha、ATF、CRE-BP1、c-Jun等多个转录因子。8、成功构建元件缺失重组载体pBF-255～-40和pBF（-44～-47）～（-107～-14）。9、双荧光素酶报告基因检测系统分析系列元件缺失质粒在EC109细胞中启动荧光素酶表达活性，表明SP1（结合位点为fascin基因上游-74～-59）可能在fascin基因转录调控过程中发挥了至关重要的作用，是食管癌细胞中fascin基因调控转录表达的关键转录因子。尽管如此，还需要采用包括Western blot、EMSA、RNAi等技术来最终证实Sp1对fascin基因在食管癌细胞中表达的调控机制。结论：综上所述，本研究初步鉴定了食管癌细胞系EC109中fascin基因的核心启动子区，且在国际上首次证实结合位点在fascin基因上游-74～-59bp的Sp1元件是调控该基因在EC109细胞中转录表达的关键元件。这一发现有助于对食管癌侵袭转移机制的了解，并为寻找针对食管癌的肿瘤靶向生物治疗方法奠定了基础。
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标签：基因论文; 食管癌细胞论文; 核心启动子区论文; 转录因子论文; 双荧光素酶报告基因检测论文;