论文摘要
研究背景:慢性粒细胞白血病（Chronic myeloid leukemia,CML）是以费城染色体（Philadephia,Ph）为特征的多潜能造血干细胞恶性克隆性疾病,其恶性克隆的持续扩充与细胞增殖和凋亡速率不平衡有关。CML具有特征性的染色体异位t（9,22）（q34,q11）,产生Bcr/Ab1融合基因,编码蛋白质P210,后者在CML的发病过程中有重要作用。研究表明,P210可促进白血病细胞增殖,延缓其凋亡。对CML的治疗,传统方法包括羟基脲、α-干扰素、异基因造血干细胞移植及近年来的酪氨酸激酶抑制剂—格列卫的应用,尽管治疗效果有很大改善,对慢粒急变的治疗效果仍不乐观。因此,寻找CML新的治疗方法仍是CML研究的目标。近年来,用传统中药提取物筛选抗白血病治疗药物获得了一些信息,如苦参碱（Matrine）、姜黄素（Curcumin）和冬凌草甲素（Oridonin）的体外试验表明可抑制多种白血病细胞增殖和诱导细胞凋亡,动物实验显示该类药物几乎无不良反应。新近上海交通大学附属瑞金医院血研所的研究显示冬凌草甲素在体内外能诱导具有t（8,21）的急性粒细胞白血病M2型（AML-M2）细胞株和原代细胞凋亡,而且副作用小,是一种潜在的抗白血病药物。因此筛选新型抗白血病中药有效成分,确定其抗白血病的作用并探讨其机制,已成为国内白血病研究领域的热点。K562细胞株系人CML急性变细胞株,既具有急性白血病细胞的特点,又具有CML细胞特有的本质,因此是体外研究筛选抗白血病药物疗效及机制的良好细胞模型。水合淫羊藿素是从淫羊藿提纯出的甙并经水解而成,分子量为368,具有抑制雌激素受体作用。本研究室以前的研究发现天然水合淫羊藿（Icaritin）对CML急红变细胞株K562细胞具有增殖抑制和诱导凋亡作用,并呈浓度依赖性。为了确定Icaritin在体外和体内是否具有确切的抗慢粒白血病效应,本研究用Icaritin对CML病人新鲜骨髓白血病细胞进行干预,观察Icaritin对CML原代白血病细胞是否具有增殖抑制、凋亡诱导作用,并对其分子机制进行探讨;用Icaritin对慢性粒细胞白血病NOD-SCID小鼠模型进行干预,观察Icaritin对慢性粒细胞白血病NOD-SCID小鼠模型是否具有延长生存期、降低白血病细胞对骨髓、肝脾的浸润,通过体内和体外试验以确定Icaritin的抗白血病作用及机制。第一部分Icaritin对CML骨髓原代细胞的增殖抑制和凋亡诱导作用目的:观察Icaritin对CML原代细胞是否具有增殖抑制和凋亡诱导效应。方法:（1）用台盼蓝拒染试验、MTT试验观察不同浓度的Icaritin对CML原代细胞增殖的抑制率的影响;（2）用Annexin V-FITC/PI染色法检测不同浓度的Icaritin干预CML原代细胞后凋亡细胞的百分率;（3）用Western印迹检测药物干预下的K562细胞Caspase-9、Caspase-3、Bax、Bcl-2、Cyt-c蛋白质表达。结果:（1）Icaritin能以浓度依赖性方式有效地抑制CML原代细胞增殖,Icaritin抑制CML原代细胞活力的IC50为13.5μmol/L（慢性期）、18μmol/L（急变期）;（2）Icaritin能以浓度依赖性方式诱导CML细胞凋亡;（3）Icaritin诱导K562细胞凋亡伴有Bcl-2和Bax相对比例的改变、细胞色素C释放和Caspase-9、Caspase-3裂解激活。结论:Icaritin能以浓度依赖性方式有效地抑制CML原代细胞增殖和诱导CML原代细胞凋亡;Icaritin诱导CML细胞凋亡的同时伴有Bcl-2和Bax相对比例的改变、细胞色素C释放和Caspase-9、Caspase-3裂解激活,提示药物诱导的CML细胞凋亡涉及到线粒体介导的细胞凋亡途径。第二部分Icaritin对K562细胞增殖抑制和凋亡诱导效应的分子机制目的:观察Icaritin作用下K562细胞增殖抑制和凋亡诱导过程中ER36、ERK、JNK、P38、c-Jun等增殖和凋亡相关蛋白表达水平的变化以及Bcr/Ab1 mRNA和蛋白表达变化,揭示Icaritin抗白血病作用的分子机制。方法:（1）用Western blot分析Icaritin作用下K562细胞ER36,ERK、P-ERK、JNK、P-JNK、P38、P-P38、c-Jun、P-c-Jun和Bcr/Ab1蛋白质表达水平;（2）用Real-time PCR定量检测Bcr/Ab1mRNA的表达量。结果:（1）Icaritin能以浓度依赖性方式抑制K562细胞ER36、P-ERK和P-P38蛋白质的表达水平,可上调P-JNK和P-c-Jun蛋白质表达;（2）Icaritin对Bcr/Ab1 mRNA和蛋白表达无明显影响。结论:Icaritin对K562细胞增殖抑制和凋亡诱导效应与其下调雌激素受体活性、调节MAPK信号转导通路有关。第三部分Icaritin对移植K562白血病细胞的NOD-SCID小鼠模型的体内抗白血病作用目的:确定Icaritin是否对负载CML细胞小鼠具有抗白血病效应。方法:建立慢性粒细胞白血病NOD-SCID小鼠模型,用不同剂量的Icaritin进行干预,并以Imatinib作为阳性对照。（1）观察CML负瘤小鼠的一般状况、生存时间;（2）通过瑞氏—吉姆萨染色观察小鼠骨髓细胞形态学变化,通过H.E染色观察小鼠肝脾病理学改变;（3）检测小鼠外周血白细胞计数和CD45+白血病细胞比例;（4）通过免疫组化检测小鼠脾脏白血病细胞ER36的表达。结果:（1）Icaritin能明显延长CML负瘤小鼠的生存期;（2）Icaritin能减轻白血病细胞对骨髓、肝脾的浸润;（3）Icaritin能降低外周血白细胞计数和CD45+白血病细胞比例;（4）Icaritin能下调白血病细胞ER36蛋白的表达,未见明显毒性反应。结论:Icaritin对鼠CML模型具有治疗作用,其抗白血病效果与Imatinib相似。