论文摘要
杆状病毒Autographa californica multicapsid nucleopolyhedrovirus（AcMNPV）可高效转导多种物种和器官来源的哺乳动物细胞。外源基因承载量大,易于构建并获得高滴度病毒,无细胞毒性等优势使杆状病毒成为一个备受关注的新型哺乳动物细胞基因转导载体。近年来,许多研究者对杆状病毒载体进行了大量的研究和改良,为其作为基因治疗载体的应用打下了良好的基础。疱疹病毒科γ亚科的Epstein-Barr病毒（EBV）与多种人类癌症密切相关,如伯杰氏淋巴瘤,霍奇金氏淋巴瘤,鼻咽癌以及胃癌等。EBV有两种截然不同的生活周期:潜伏性感染和裂解性复制。EBV的1型核抗原EBNA-1是潜伏复制期间唯一必需的病毒蛋白。它可以利用宿主细胞的复制系统,从潜伏复制原点OriP起始病毒基因组的潜伏复制。OriP还是一个依赖于EBNA-1的增强子,当结合EBNA-1后,可有效提高邻近基因的表达水平。由于EBV几乎存在于所有相关肿瘤细胞内,因此可作为肿瘤基因治疗的重要靶标。通过外源表达EBV极早期基因Rta,激活EBV的裂解性复制,最终导致所在细胞的裂解死亡,被证明是一种有效的,极具潜力的治疗手段。但这种方法的实际应用还需要更为高效特异的基因转导手段。本研究首先构建了携带Rta基因表达框的重组杆状病毒BV-R。用该病毒转导EBV潜伏感染的细胞系D98/HR1后,Rta基因得到了表达。而且,在丁酸钠存在的情况下,BV-R成功激活EBV进入裂解性复制周期。以200pfu/cell的感染复数感染细胞48小时后,BV-R对细胞的杀伤率达到17%,添加丁酸钠可使杀伤效果扩大到25%以上。杆状病毒载体对EBV阴性细胞Hela的毒性作用远小于腺病毒载体,几乎无可见影响。为了使杆状病毒载体取得更好的杀伤肿瘤细胞效果,利用EBV潜伏复制系统EBNA-1/OriP对其进行改造,构建了携带OriP和Rta基因表达框的重组杆状病毒BV-RO,以及EBNA-1/OriP和Rta表达框的重组杆状病毒BV-ROE-CMV。用杆状病毒载体分别感染3株EBV阳性鼻咽癌细胞Hone1-EBV,HK1-EBV和C666-1后发现,与BV-R相比,BV-RO和BV-ROE-CMV均更显著地诱导了EBV裂解复制期蛋白RTA,EA-D和VCA的表达,并使Hone1-EBV细胞内EBV基因组拷贝数增加了约10倍。BV-RO和BV-ROE-CMV对这3株细胞生长活性的抑制率达到40%～50%,而对于EBV阴性的鼻咽癌细胞Hone1无明显影响。进一步研究了杆状病毒载体在活体水平对肿瘤生长的抑制作用。首先以Honel-EBV细胞株在裸鼠中建立鼻咽癌移植瘤模型。向肿瘤直接注射杆状病毒载体后比较肿瘤生长发现,与对照病毒和PBS组相比,BV-RO和BV-ROE-CMV两种载体对肿瘤生长的抑制效果明显,19天后,肿瘤平均体积只有对照的30%。进一步分析发现,两种载体成功诱导了肿瘤组织中EBV早期蛋白EA-D的表达,但未检测到晚期基因的表达,提示肿瘤中的EBV被激活进入裂解性复制,但却由于某种原因未能进行完全。推测细胞的大量死亡并不是由于子代病毒粒子裂解细胞所致,而是由于RTA本身所引起的细胞凋亡,或EBV裂解性复制的某些早期事件对细胞造成的伤害所致。我们首次成功地将杆状病毒载体用于EBV相关肿瘤的基因治疗,证明添加OriP和EBNA-1元件可以显著增强杆状病毒载体的治疗效果。因为EBV阳性细胞中病毒都会表达EBNA-1蛋白,而正常细胞则没有EBNA-1,因此重组杆状病毒载体BV-RO只有在EBV阳性的肿瘤细胞中才会特异性高表达Rta基因,从而在有效抑制EBV相关肿瘤增殖的同时,对EBV阴性细胞不会产生显著的抑制作用。因此BV-RO有望成为一个安全、高效的EBV相关肿瘤基因治疗候选载体,进行进一步的研究和应用。