维生素K2对人肝细胞肝癌表达脱-γ-羧基凝血酶原（Des-γ-carboxy-prothrombin，DCP）抑制作用观察

论文摘要

背景和目的:脱—γ—羧基凝血酶原（Des-γ-carboxy-prothrombin,DCP）是肝细胞肝癌产生的异常凝血酶原,其机制可能与肝癌细胞缺乏或对维生素K利用障碍,造成依赖维生素K的γ谷氨酰羧化酶及辅酶活性降低,导致内质网产生的凝血酶原N端10个谷氨酸残基羧化不全致DCP大量产生并分泌至血液中。我们认为,DCP不但可以作为肝细胞癌（hepatocellular carcinoma cells HCC）诊断的标志物,更重要的作用在于其可能具有刺激肝癌细胞增殖作用。所以,抑制肝癌细胞DCP的产生和降低血液中含量,可能达到抑制DCP对肝癌细胞的进一步刺激增殖作用,达到辅助治疗肝癌的目的。维生素K类药物及其衍生物被发现可能具有一定的抑制肝癌细胞产生DCP作用,降低血液DCP水平,有效抑制肝癌细胞生长,改善临床症状,作用机制可能与其促进肝癌细胞γ谷氨酰羧化酶活性有关。本研究通过实验观察了维生素K2对肝细胞肝癌的抑制作用,证实了其与降低DCP表达之间的相关性。实验方法:体外实验,以MTT法检测了VitK2对人肝癌细胞（HCC）生长抑制作用,以集落形成法测定VitK2对长时间接触肿瘤细胞克隆原细胞的抑制活性。以Transwell小室模型方法观察了VitK2对HCC细胞体外侵袭能力的抑制作用。体内实验,以裸鼠接种人肝癌细胞,灌胃给予VitK2,观察其对HCC细胞的生长抑制作用。DCP表达水平检测方法,以ELISA法检测体外培养细胞上清液和动物血液DCP水平;以Western blot和免疫组织化学法分析HCC细胞DCP表达状态。实验结果:体外结果显示,不同剂量VitK2与HCC细胞孵育不同时间,VitK2对HCC增殖具有一定的生长抑制作用,并呈现剂量和接触时间依赖性关系。VitK2具有明显抑制HCC细胞侵袭和穿过Matrigel的能力,其对肿瘤细胞的抑制增殖作用在裸鼠移植HCC细胞实验中得到证实。在研究VitK2抑制HCC细胞增殖与DCP表达水平相关性方面,VitK2（2-40μM）明显降低HCC细胞培养上清液中DCP表达水平,对HCC生长抑制作用和DCP水平下降呈现相关性,这种作用在裸鼠移植人肝癌细胞表达DCP及VitK2治疗实验中得到证实。结论:VitK2具有抑制人肝癌细胞增殖的作用,其机制与降低细胞表达DCP水平有关。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 符号说明
• 前言
• 实验部分
• 主要实验材料
• 实验方法
• 1.细胞培养
• 2.药物配制
• 3.药物对细胞生长的影响
• 3.1 VitK2对PLC/PRF/5细胞生长影响
• 3.2 VitK2对HepG2细胞生长的影响
• 4.集落形成法测定VitK2对肿瘤克隆原细胞抑制实验方法
• 4.1 VitK2对PLC/PRF/5细胞生长的抑制
• 4.2 VitK2对HepG2细胞生长的抑制
• 5.Transwell小室模型测定细胞体外侵袭能力
• 6.DCP水平测定
• 6.1 ELISA方法测定DCP的水平
• 6.2 Westernblot分析HCC细胞DCP表达
• 7.体内实验方法
• 7.1 人肝细胞癌裸鼠移植瘤模型建立
• 7.2 实验动物分组和给药方法
• 7.3 标本的制备
• 7.4 免疫组织化学
• 8.统计学分析
• 实验结果
• 1.VitK2对HCC细胞生长抑制作用
• 2.VitK2对人肝肝癌克隆原细胞抑制作用
• 3.VitK2抑制PLC/PRF/5细胞侵袭作用
• 4.对人肝细胞癌裸鼠移植瘤抑制作用
• 5.VitK2抑制HCC细胞DCP表达作用
• 5.1 ELISA法测定结果
• 5.2 Western blot实验结果
• 5.3 免疫组化法观察VitK2的影响
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表论文
• 附件
• 学位论文评阅及答辩情况表