论文摘要
背景：乙型肝炎病毒（HBV）感染是一个全球性的高危害性的疾病。1965年HBV作为人类感染的一种主要病原体发现于非白血性白血病病人和澳大利亚土著居民中。现全世界将近有三分之一的人口感染HBV病毒，慢性HBV感染常常会导致肝硬化、肝衰竭甚至肝细胞癌的发生。慢性乙型肝炎的治疗药物目前主要是干扰素α和核苷类似物，但两者都不能清除cccDNA，故而停药后病情往往会反复。机体特异性细胞免疫应答是清除病毒感染的关键。细胞毒性T淋巴细胞（CTL）是抗病毒免疫和抗肿瘤免疫的最为重要的效应细胞，它们能够识别细胞表面的MHCⅠ类分子递呈的病毒或肿瘤相关抗原肽，从而清除病毒或杀伤肿瘤细胞。因此，诱导活化特异性CTL是临床免疫治疗的主要目标。树突状细胞作为机体内最强大的抗原递呈细胞，也是机体免疫反应的始动者和调节者，它能够通过MHCⅠ和MHCⅡ分子途径递呈抗原，在特异性体液和细胞免疫应答中均发挥着十分重要的作用，并与慢性乙肝的发病机理和预后转归都有十分紧密的联系。以DC为基础的免疫治疗已成为慢性HBV感染和慢性乙型肝炎治疗研究的一个新方向。为此，我们应用脂质体转染方法构建人HBcAg核酸DC疫苗，以期能够诱导产生更有效的特异性CTL免疫应答。目的：本文旨在研究以阳离子脂质体为载体将HBcAg基因转入人DC，构建人HBcAg核酸DC疫苗，通过对其HBcAg的表达率，刺激自体淋巴细胞分泌细胞因子IFN-γ及其对HepG2.2.15细胞的杀伤能力的研究观察，为今后HBcAg基因修饰的DC疫苗的临床应用奠定实验基础。方法：1．细胞的分离和培养：用HES离心沉淀法分离人外周血人外周血单个核细胞（PBMC），经粒-巨细胞集落刺激因子（GM-CSF）、白细胞介素-4（IL-4）诱导培养DC，倒置显微镜下观察细胞形态，流式细胞术检测其细胞表面分子标志。2．细胞转染效率的测定：培养第5d以阳离子脂质体为载体，将GFP报告基因（DNA：脂质体比例为1：3、1：4、1：5、1：6）及HBcAg基因（DNA：脂质体1：5）导入人DC，于72h经流式细胞仪检测绿色荧光蛋白（GFP）的表达率，于48、72、96、120h流式细胞仪检测HBcAg的表达率。3．转染后细胞表面标志的测定：细胞转染48hs后收集DC，加入单克隆抗体抗人抗体HLA-DR-FITC，CD86-PE、CD1a-FITC、CD80-PE、CD83-FITC、CD40-PE，流式细胞仪检测转染组和未转染组各种细胞表面分子的表达。4．免疫荧光法检测HBcAg的表达：转染的DC用冷丙酮固定30 min，5％BSA室温封闭1 h，加入鼠抗人HBcAg单克隆抗体室温反应1 h，蒸馏水洗涤3遍后加FITC荧光标记的羊抗鼠单克隆抗体IgG室温反应45 min，荧光显微镜观察细胞荧光。5．混合培养：将DC分为转染HBcAg基因组pJW4303／HBc-DC、转染空载质粒组pJW4303-DC、未转染组DC三组，复苏自体淋巴细胞，将淋巴细胞与三组DC均按照10：1的比例混合培养。6．IFN-γ的测定：分别将pJW4303／HBc-DC、pJW4303-DC及未转染的DC与自体淋巴细胞混合培养5天后，收集三组细胞采用Elispot方法检测淋巴细胞IFN-γ的分泌情况。7．CTL试验：以pJW4303／HBc-DC、pJW4303-DC、DC三组细胞为刺激细胞，活化自体淋巴细胞使其成为效应细胞，以HepG2.2.15为靶细胞，检测效应细胞对靶细胞的杀伤能力。结果：1．细胞形态及表面标志：人外周血单核细胞经GM-CSF、IL-4联合诱导培养，于第5天收获细胞，其DC形态典型，混杂细胞少。经FACS检测其表面分子的表达分别为：CD1a：39.02％，CD80：77.86％，HLA-DR：64.87％，CD86：91.13％，CD83：30.89％，CD40：72.97％。2．流式细胞仪检测转染效率：以脂质体为介质转染HBcAg基因的DC，倒置显微镜下观察其形态无明显变化。报告基因GFP与脂质体比例不同，其转染效率有差异，72h的表达率为37.12％（1：3）、48.55％（1：4）、52.13％（1：5）、50.75％（1：6）。HBcAg基因转染DC后48、72、96、120h的HBcAg表达率分别为31.58％、55.8％、54.18％、56.99％。3．转染后细胞表面分子的变化：转染pJW4303／HBc组HLA-DR，CD86、CD1a、CD80、CD40、CD83的表达率分别为：71.6±3.26％、95.86±1.96％、36.43±3.31％、86.70±3.19％、70.13±1.78％、66.70±2.51％，未转染组分别为：73.15±3.22％、94.83±3.36％、39.35±3.44％、77.73±2.31％、72.73±4.85％、30.63±3.49％，两组相比，转染后的CD83比未转染组表达增高，有统计学意义（P＜0.05），其余的表面分子的表达无明显差异（P＞0.05）。4．免疫荧光法检测转染细胞：转染细胞加入单克隆HBcAg抗体和荧光抗体后，在荧光显微镜下可以观察到pJW4303／HBc转染后DC胞质和胞膜出现黄绿色荧光，而未转染基因的对照组DC无明显荧光表达。5．自体淋巴细胞IFN-γ的分泌：pJW4303／HBc-DC组能够有效活化自体淋巴细胞，并分泌IFN-γ。6．CTL结果显示，选择效靶比为10：1、20：1、40：1时，pJW4303／HBc-DC组的杀伤率分别为：（62.5±4.8）％、（71.8±5.3）％、（81.5±5.0）％；pJW4303-DC组为：（19.5±1.5）％、（36.8±3.0）％、（43.8±4.4）％；未转染DC组为：（16.1±3.3）％、（33.6±5.2）％、（44.0±3.7）％。试验组和对照组相比有统计学差异（P＜0.05）。结论：应用阳离子脂质体能有效的将HBcAg基因转染到人PBMC来源的DC，转染72h后抗原表达稳定；转染HBcAg基因的DC其表面分子CD83表达增高，表明转染HBcAg基因后促使DC成熟；转染HBcAg基因的DC能够更有效地刺激自体淋巴细胞分泌IFN-γ并诱导特异性的CTL反应。
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