论文摘要
【目的】MDA-MB-231乳腺癌细胞系在p53基因外显子8上具有突变位点。反义拯救是在突变位点被其相对应反义RNA特异性封闭的同时，补充野生型p53基因的双重基因治疗。本实验是在前期研究结果的基础上探讨针对p53外显子8突变位点的反义RNA（ASp53exon8’RNA）和野生型p53基因（wt-p53）二者共同转染MDA-MB-231细胞系后细胞周期改变及其蛋白表达情况，以及二者作用于MDA-MB-231乳腺癌细胞系接种成瘤的裸鼠后，对肿瘤生长的抑制作用，以及反义拯救联合化疗药顺铂治疗荷瘤鼠肿瘤的治疗效果。【方法】1、以含MDA-MB-231细胞中突变p53外显子8的反义表达载体为模板，体外转录制备突变p53反义RNA单链分子ASp53exon8’RNA；2、在脂质体介导下，将ASp53exon8’RNA和含有wt-p53的重组质粒pCDNA3.1-p53共同转染MDA-MB-231细胞，流式细胞技术检测细胞周期分布、Westernblot检测mt-p53蛋白的表达情况；3、建立裸鼠人乳腺癌移植瘤模型；4、摸索ASp53exon8’RNA和顺铂的给药方式和剂量；5、按最佳给药剂量和方式进行“反义拯救”双基因治疗及联合顺铂治疗的实验研究，包括治疗效果和毒理性研究两个内容。游标卡尺定期测量肿瘤的长径和短径并计算体积，绘制肿瘤生长曲线，计算抑瘤率，治疗结束后肿瘤组织HE染色观察肿瘤组织的变化、免疫组化测定突变型p53蛋白的阻断情况。【结果】1、反义拯救即将ASp53exon8’RNA和含野生型p53的质粒pCDNA 3.1-p53在脂质体介导下共同转染MDA-MB-231细胞，转染后48小时引起：（1）流式细胞仪检测细胞周期明显阻滞于G2／M期，较单独ASp53exon8’RNA转染组和单独wt-p53转染组更显著，与对照组有统计学差异；（2） Westernblot显示转染细胞mt-p53蛋白表达受抑制，为对照组的84.29％，有统计学意义。2、确定了荷瘤裸鼠实验的反义拯救及顺铂的最佳给药方式和剂量：正、反义RNA及野生型P53质粒均为10ug／只裸鼠，瘤内注射；顺铂3mg／kg体重qd*3d三周为一疗程腹腔注射3、反义拯救（ASp53exon8’RNA和含野生型p53的质粒pCDNA 3.1-p53在脂质体介导下瘤周注入荷瘤鼠）获得了预想的效果：1)裸鼠肿瘤生长受到抑制，生长速度减慢；2)病理组织学检查结果显示经反义拯救治疗的肿瘤组织呈大面积完全坏死改变，与对照组比较效果明显；3) p53免疫组化染色显示经反义拯救治疗后的肿瘤组织内的mt-p53蛋白表达大部分转为阴性，与对照组比较效果明显。4、反义拯救联合顺铂增加了治疗的效果：肿瘤生长抑制、肿瘤组织坏死及p53突变蛋白表达抑制均比对照组，尤其比单用顺铂组效果显著。5、反义拯救无毒理性反应：经反义拯救治疗的裸鼠一般状态及心、脑、肝、脾、肺、肾、肾上腺、胃肠、皮肤等器官组织与对照组相比未见任何异常改变。【结论】1、向人乳腺癌细胞系MDA-MB-231（含突变型p53外显子8）中转染野生型p53基因和针对其突变的反义RNA分子进行反义拯救双重基因治疗，可以有效的阻滞细胞周期和抑制突变p53蛋白的表达。2、反义拯救较单一的反义阻断、野生型补充及顺铂治疗组具有更明显的治疗效果；3、反义拯救具有特异性和靶向性，仅作用于具有突变的肿瘤细胞；4、反义拯救联合化疗药顺铂治疗乳腺癌具有相互协同促进作用。