论文摘要
研究目的（1）克隆并分析小鼠及阴道毛滴虫（Trichomonas vaginalis）长寿保障基因LAG1启动子，为进一步研究在细胞衰老过程中LAG1基因的转录调控奠定基础；（2）克隆阴道毛滴虫肌动蛋白基因片段，表达及纯化肌动蛋白重组蛋白，免疫豚鼠获得抗血清，为进一步研究肌动蛋白在阴道毛滴虫体内定位及其在细胞衰老过程中的作用奠定基础。材料与方法（1）利用Promoter 2.0在线分析软件（http://www.cbs.dtu.dk/errices/Promoter/），取LAG1（LASS1）基因起始密码子上游约3000bp进行分析，根据分析结果，用PCR技术扩增启动子区序列，将PCR产物克隆入pGEM-T-Easy载体，并分别亚克隆入荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic及增强型绿色荧光蛋白报告基因载体pEGFP-1，用脂质体介导的方法瞬时转染EC109细胞，48h后测定荧光素酶表达活性及观察绿色荧光蛋白的表达情况。（2）应用PCR方法获得阴道毛滴虫肌动蛋白基因部分片段，克隆入pGEM-T-Easy载体，并亚克隆入表达载体pET-41a，转化大肠埃希菌（E．coli）BL21，异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（isopropylthio-β-D-galactoside, IPTG）诱导重组质粒表达，亲和层析纯化表达产物，Brandford法测定重组蛋白含量并免疫豚鼠，用SDS-PAGE和Western blot进行分析鉴定。结果（1）通过在线启动子分析软件发现在阴道毛滴虫LAG1基因5′端-400bp～+50bp区域内含有启动子的可能性很大，虽然在转录起始点附近缺乏经典的TATA，CAAT及GC保守序列，但检测到5个GATA-1、七个Oct-1结合位点保守序列。据此设计了六对引物并构建了六种荧光素酶报告基因表达体系及两种增强型绿色荧光蛋白报告基因表达体系，其中表达载体pGL3-455（-455bp～+55bp）、pGL3-417（-417bp～+55bp）、pGL3-280（-280bp～+55bp）、pGL3-202（-202bp～+55bp）、pGL3-81（-81bp～+55bp）的荧光素酶表达活性相近，均明显高于表达载体pGL3-47（-47～+55）荧光素酶表达活性，而pGL3-47表达载体荧光素酶表达活性极低，与阴性对照活性相近，提示-47bp～+55bp区无启动子活性。绿色荧光蛋白的表达情况为pEGFP-81（-81bp～+55bp）有明显的绿色荧光蛋白表达，而pEGFP-47（-47bp～+55bp）和空载体pEGFP-1未见表达。（2）通过在线启动子分析软件发现在小鼠LASS1基因5′端-600bp～+50bp区域内含启动子的可能性较大，而且在转录起始点附近未发现保守的TATA盒，CAAT盒及GC盒等典型的启动子元件，但检测到两个SP1结合位点保守序列。两个SP1结合位点位于转录起始点上游-181bp区域内。据此设计了三对引物并构建了三种荧光素酶报告基因表达体系及三种增强型绿色荧光蛋白报告基因表达体系，分别为pGL3-501（-501bp～+106bp）、pGL3-181（-181bp～+106bp）和pGL3-26（+26～+106）及pEGFP-501、pEGFP-181和pEGFP-26。pGL3-501表达载体与pGL3-181表达载体荧光素酶表达活性相近，而pGL3-26表达载体荧光素酶表达活性极低，与阴性对照活性相近，+26bp～+106bp无启动子活性。绿色荧光蛋白的表达情况也类似，pEGFP-501和pEGFP-181有明显的绿色荧光蛋白表达，而pEGFP-26和空载体pEGFP-1无表达活性。（3）肌动蛋白基因的PCR产物片段大小500bp；构建了阴道毛滴虫肌动蛋白基因重组表达质粒；表达了肌动蛋白重组蛋白；SDS-PAGE显示分离纯化的肌动蛋白重组蛋白为47kDa；Western blot结果表明所获得抗血清可与肌动蛋白重组蛋白在47kDa及阴道毛滴虫总蛋白在41kDa处特异性反应。结论（1）在阴道毛滴虫LAG1基因5′端-81bp～-47bp区域含有基因转录所必需的基本启动子序列。（2）在小鼠LASS1基因5′端-18lbp～+26bp区域含有该基因转录所必需的基本启动子序列，其中两个SP1保守序列是小鼠LASS1基因启动子所必需的。（3）阴道毛滴虫重组肌动蛋白获得高效表达，其免疫豚鼠获得的抗血清可与该肌动蛋白重组蛋白反应，也可识别阴道毛滴虫虫体肌动蛋白，该抗血清可用于进一步研究。