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微生物转化植物甾醇制备甾体药物关键中间体研究

2020-12-07阅读(612)

微生物转化植物甾醇制备甾体药物关键中间体研究

论文摘要

甾体激素类药物是临床上不可缺少的一类重要药物。雄甾-4-烯-3,17-二酮（Androst-4-ene-3,17-dione,简称：雄烯二酮或AD）是甾体激素类药物不可替代的中间体,对机体起着非常重要的调节作用,可以说几乎所有甾体激素类药物都是以其作为起始原料进行生产的。目前,国内外对甾体药物的需求量很大,所以,AD具有广阔的市场前景。本文研究微生物转化植物甾醇制备AD关键技术。主要研究以植物甾醇为原料,通过微生物转化技术将甾醇边链选择性切除制备AD的一种主要方法。结论如下：（1）生物转化法生产AD还未实现大规模工业化生产的主要原因之一是AD转化率低。以Mycobacterium sp.BD696为出发菌株,分别采用UV照射,60C o照射,UV+60 C o复合诱变处理筛选获得一株高转化率突变株Mycobacterium sp-UC-8,其产生AD的能力较出发菌株提高了39.2%,且不再产生结构类似副产物雄二烯二酮（ADD）,传至第五代产率仍较为稳定,展示UV+60 C o复合诱变是遗传育种的一种有效方法。结合生产的实际情况,建立了微生物转化植物甾醇为AD的检测方法：先用TLC薄层层析法分析,后有选择性的进行气相色谱检测。（2）针对底物疏水性问题,对分枝杆菌在双水相转化系统中生产AD工艺作了一系列研究。研究了高聚物/无机盐双水相系统、高聚物/高聚物双水相系统对转化的影响；同时研究了高聚物/高聚物总浓度对甾醇转化的影响。试验结果表明：不同高聚物组成的双水相系统都可以满足将甾醇转化为AD的要求,而且明显比在高聚物与无机盐双水相系统中转化率高：总浓度20%时转化率较高,且PEG10000和DEX20000的浓度分别为12%和8%时,转化率达到了50%左右,较浓度均为10%时提高了5%：研究了双水相体系中不同缓冲液、不同初始pH值对转化的影响,研究表明：pH值对转化率影响很大,pH为8.0～8.5,利于甾醇向AD转化,其中磷酸缓冲液中pH 8.5,最高转化率达到50.1%,且没有ADD生成；pH在4.0～6.5时利于甾醇向ADD转化,柠檬酸缓冲液中,pH5.5时ADD最高转化率达到15.9%。（3）研究了双液相系统中,植物甾醇微生物转化制备AD的工艺以及底物投料量、表面活性剂和添加酶制剂对降解的影响。结果表明：葵花油是分枝杆菌降解甾醇生成AD的最佳有机溶剂,底物投料量、添加羟化酶抑制剂对转化有一定的影响。通过正交试验,确定了葵花油/水系统最优转化条件：葵花油浓度为20%,底物投料量为0.4%,添加剂为0.005%氯化汞,此工艺条件下,AD转化率高达83.4%。（4）研究了分枝杆菌Mycobacterium SP-UC-8利用植物甾醇生产AD的机理,考查了酶抑制剂、促进剂、诱导剂对转化得率及生物量的影响。结果表明：添加低浓度诱导剂甾醇可提高AD产量,当菌种生长12h时加入诱导剂,添加量为0.15g/L时脱氢酶活力最高,此时AD含量为2.46g/L,转化率为84.2%,发酵周期由168h缩短到144h；低浓度ZnSO4.7H2O对酶活性具有促进作用,浓度为0.1g/L时AD含量达到2.50g/L, ZnSO4.7H2O浓度上升到0.3g/L后,ZnSO4.7H2O对△3-脱氢酶活性产生抑制作用,导致AD产量明显降低；9a羟化酶抑制剂HgCl2可以抑制AD的进一步降解,使AD的产率上升了3.4%,但对菌体消耗多糖及生物量的影响不大。（5）通过单因素实验,均匀实验设计及响应面法分析对培养基成分进行了优化。得到最优培养基成分为：废糖蜜58.4925mL/L,葵花油211.6283 mL/L,甾醇6.0119g/L,硝酸氨3.2 g/L,磷酸氢二氨0.8 g/L,氯化汞0.055 g/L。在此条件下,AD产量达到2.5486g/L,且重复性试验结果较好。根据中心组合设计原理,通过SAS（?） Systemfor Windows 9.0对葵花油、废糖蜜、甾醇三个因素进行响应面分析,拟合出响应面及等高线图；建立了葵花油,废糖蜜,甾醇三因素五水平的响应面回归模型,并对模型经过失拟、F和t检验,证明该模型在该试验条件下能反映生物转化植物甾醇过程的内部规律。分析了三因素和双因素及交互作用对AD转化率的影响,比较分析了各因素对转化率影响大小：依次为废糖蜜>葵花油>甾醇；甾醇和废糖蜜、废糖蜜与葵花油均存在交互作用但影响不显著,葵花油与甾醇之间存在显著的交互作用。（6）对分枝杆菌的转化条件进行了优化。得到了最佳转化条件：温度为30℃,摇床转速为220r/min,接种量为10%,初始pH为8.2。研究了转化过程中pH的变化规律。试验发现pH在5-9较宽的范围内,分枝杆菌仍然能够生长、存活。表明当环境pH值（简称pHout）变化时,为了保护细胞,微生物有一套控制细胞内pH（简称pHin）的系统,这些pHin调控系统包括细胞质缓冲物质、酸或碱物质及通过离子泵向胞外运输H+,这样其pHin仍然维持中性或接近中性范围内。（7）研究了分枝杆菌的菌体生长、基质消耗及产物生成的特征,基于Logistic方程、Leudeking-piret方程,建立了描述分批发酵过程的动力学模型及模型参数,对实验数据与模型进行了验证比较,平均相对误差均小于7%,模型计算值与试验数据拟合良好,基本反映了分枝杆菌分批发酵过程的动力学特征,表现出很好的适用性。运用MATLAB软件进行非线性曲线拟合,得参数a=0.2320,β=0.0007,均不等于零,证明产物的生成与细胞生长属部分偶联型；在此基础上进行了5L-5000L发酵罐逐级工艺放大,为产业化设计和生产提供了可靠的依据。（8）研究从双水相系统发酵液油相分离提取AD的新方法。重点对浓缩过程中NaCl添加量、静置时间、萃取比等操作参数进行了优化选择。结果表明：添加70g/L的NaCl,静置8h,用乙醇以1.5：1（v/v）的萃取比萃取,浓缩效果达到最好。实验确定了AD精制工艺,制备的精品AD干燥失重=0.5%、熔点168～173℃、比旋度检测+193°～+202°,含量94.5%（HPLC）,达到AD企业质量标准。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 谢辞
  • 第一章 绪论
  • 1.1 AD、植物甾醇简介
  • 1.1.1 AD的分子结构及理化性质
  • 1.1.2 植物甾醇结构特点
  • 1.2 AD的应用
  • 1.3 AD的制备途径
  • 1.3.1 化学合成法
  • 1.3.2 微生物转化法
  • 1.4 微生物转化植物甾醇制备AD机理
  • 1.4.1 羟化反应机理
  • 1.4.2 脱氢反应机理
  • 1.4.3 甾核的降解
  • 1.4.4 异构化
  • 1.5 AD研究现状和研究重点
  • 1.5.1 AD研究现状
  • 1.5.2 目前国内外对AD研究重点
  • 1.6 微生物转化法制备AD技术应用前景
  • 1.7 论文的研究目的与意义
  • 1.8 主要存在的问题
  • 1.9 主要研究内容
  • 参考文献
  • 第二章 AD转化菌的复合诱变及性能检测
  • 2.1 材料和方法
  • 2.1.1 菌种
  • 2.1.2 主要试剂及仪器
  • 2.1.3 培养基和培养条件
  • 2.2 实验方案
  • 2.2.1 出发菌株的性能测定
  • 2.2.2 菌种诱变方案
  • 2.2.3 诱变系谱图
  • 2.2.4 菌种的诱变与筛选方法
  • 2.2.5 最优突变株的性能测定
  • 2.2.6 分析方法
  • 2.2.7 检测方法
  • 2.3 结果与讨论
  • 2.3.1 AD检测方法的确定
  • 2.3.2 诱变效果
  • 2.3.3 稳定性试验
  • 2.4 本章小结
  • 参考文献
  • 第三章 双水相系统中微生物转化植物甾醇制备AD研究
  • 3.1 材料与方法
  • 3.1.1 菌种
  • 3.1.2 主要试剂及仪器
  • 3.1.3 培养基和培养条件
  • 3.2 试验方案
  • 3.2.1 浓度标准曲线的绘制
  • 3.2.2 双水相系统的构建
  • 3.2.3 试剂的配制
  • 3.3 结果与讨论
  • 3.3.1 高聚物与无机盐双水相系统对转化率的影响
  • 3.3.2 不同高聚物双水相系统对转化率的影响
  • 3.3.3 高聚物总浓度对转化率的影响
  • 3.3.4 PEG10000与DEX20000百分含量之比对转化率的影响
  • 3.3.5 缓冲溶液pH和不同缓冲体系对系统转化率的影响
  • 3.4 本章小结
  • 参考文献
  • 第四章 双液相系统中微生物转化植物甾醇制备AD研究
  • 4.1 材料与方法
  • 4.1.1 菌种
  • 4.1.2 主要试剂及仪器
  • 4.1.3 培养基和培养条件
  • 4.2 试验方案
  • 4.2.1 有机溶剂的选择
  • 4.2.2 底物甾醇添加量对AD转化率的影响
  • 4.2.3 添加剂对系统的影响试验
  • 4.2.4 正交试验设计
  • 4.3 结果与讨论
  • 4.3.1 有机溶剂对AD转化的影响
  • 4.3.2 底物投料量对AD转化的影响
  • 4.3.3 添加剂
  • 4.3.4 正交实验
  • 4.4 本章小结
  • 参考文献
  • 第五章 Mycobacterium SP-UC-8制备AD的机理研究
  • 5.1 材料与方法
  • 5.1.1 菌种
  • 5.1.2 主要试剂及仪器
  • 5.1.3 培养基和培养条件
  • 5.2 实验方案
  • 5.2.1 分析方法
  • 5.2.2 生物量测定
  • 5.2.3 实验技术
  • 5.3 结果与讨论
  • 5.3.1 酶诱导剂对AD转化的影响
  • 5.3.2 酶诱导剂对AD转化过程的影响
  • 5.3.3 酶促进剂对AD转化过程影响
  • 2对分枝杆菌发酵液中生物量及多糖的影响'>5.3.4 抑制剂HgCl2对分枝杆菌发酵液中生物量及多糖的影响
  • 5.4 本章小结
  • 参考文献
  • 第六章 Mycobacterium SP-UC-8制备AD培养基的优化
  • 6.1 材料与仪器
  • 6.1.1 菌种
  • 6.1.2 主要试剂及仪器
  • 6.1.3 培养基和培养条件
  • 6.2 实验方案
  • 6.2.1 碳源优化实验
  • 6.2.2 氮源优化实验
  • 6.2.3 磷酸盐优化实验
  • 6.2.4 培养基优化均匀实验设计
  • 6.2.5 响应面分析法优化培养基
  • 6.3 结果与讨论
  • 6.3.1 碳源对AD转化的影响
  • 6.3.2 氮源对AD转化的影响
  • 6.3.3 磷酸盐对AD转化的影响
  • 6.3.4 响应面分析法培养基优化结果
  • 6.4 本章小结
  • 参考文献
  • 第七章 Mycobacterium SP-UC-8制备AD工艺优化及转化动力学研究
  • 7.1 材料与仪器
  • 7.1.1 菌种
  • 7.1.2 主要试剂与仪器
  • 7.1.3 培养基和培养条件
  • 7.2 试验方案
  • 7.2.1 菌浓测定
  • 7.2.2 总糖的测定
  • 7.2.3 培养条件的优化
  • 7.2.4 数据处理方法
  • 7.2.5 转化罐放大试验
  • 7.3 结果与讨论
  • 7.3.1 培养条件对转化结果的影响
  • 7.3.2 Mycobacterium sp-UV-8的摇瓶分批转化过程
  • 7.3.3 摇瓶转化动力学模型的建立
  • 7.3.4 模型的解
  • 7.3.5 模型的验证
  • 7.3.6 转化罐放大试验
  • 7.4 本章小结
  • 参考文献
  • 第八章 AD提取工艺研究
  • 8.1 实验材料与仪器
  • 8.1.1 菌种
  • 8.1.2 主要试剂与仪器
  • 8.2 实验方案
  • 8.2.1 萃取剂的选择
  • 8.2.2 转化液的浓缩
  • 8.2.3 浓缩液的纯化
  • 8.2.4 AD提取工艺流程图
  • 8.2.5 产品品质检测
  • 8.3 结果与分析
  • 8.3.1 萃取剂的选择
  • 8.3.2 NaCl添加量单因素试验结果
  • 8.3.3 静置时间单因素试验结果
  • 8.3.4 萃取比单因素实验结果
  • 8.3.5 正交实验结果
  • 8.3.6 AD产品的精制与检测
  • 8.4 本章小结
  • 参考文献
  • 第九章 结论与展望
  • 9.1 主要结论
  • 9.2 论文创新点
  • 9.3 研究前景
  • 攻读博士学位期间发表的论文
  • 专利
  • 主持项目

    • 相关论文文献

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