玉米双低频酶cDNA-AFLP体系的建立及穗数性状相关基因的差异表达分析

论文摘要

cDNA—AFLP技术结合了AFLP和RT—PCR的优点,无需了解序列信息便可显示基因组表达序列的差异。该技术灵敏性高,重复性好,可对生物体转录组进行全面、系统的分析。但开展cDNA—AFLP研究,需要较高的费用。本研究建立了玉米双低频酶cDNA-AFLP技术体系,该体系经济有效;并将它用于玉米穗数性状相关基因的差异表达研究,取得了良好的结果。其主要研究内容和结果如下:1.玉米双低频酶cDNA-AFLP体系的建立以玉米自交系QCL1094为材料,先用RNAiso Reagent、柱式试剂盒法、异硫氰酸胍法等三种方法提取苗期叶片总RNA;然后,用PrimescriptTM1st Strand cDNASynthesis Kit反转录获得第一链cDNA,用RNase H、E.coli DNA聚合酶I和E.coliDNA连接酶合成第二链cDNA,用T4 DNA聚合酶进行末端平滑得到双链cDNA;最后,用双低频酶EcoRI和Pst I酶切双链cDNA,用T4 DNA连接酶连接接头,用引物EA00和P00进行预扩增,用引物EA01和P01进行选择性扩增。经1%琼脂糖凝胶和6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,结果表明本研究的RNA提取及cDNA-AFLP预扩增和选择性扩增的效果良好。上述技术体系既经济又有效,可为cDNA-AFLP技术的应用提供参考。2.玉米穗数性状相关基因的差异表达分析用多穗玉米自交系QCL6004、双穗玉米自交系QCL1010和单穗玉米自交系QCL1007、QCL1168、QCL1178、AL29-2为亲本材料,采用连续回交方法,构建多穗玉米系的双穗或单穗近等基因材料以及双穗玉米系的单穗近等基因材料。取亲本和近等基因材料的苗期叶片、穗分化时期叶片和生长点、吐丝期花丝、灌浆期籽实等作为实验材料,采用上述技术体系,选取EA系列引物6条和P系列引物6条组成36对引物进行穗数性状相关基因的差异表达分析。目前已经找到6条差异片段,其中在BC3花丝时期,找到2条差异片段,在BC4苗期,找到4条差异片段。这些差异片段的测序工作正在进行。

论文目录

• 目录
• 英文缩略词
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一部分 文献综述
• 1 玉米概述
• 2 植物分子标记的研究进展
• 2.1 第1代分子标记
• 2.1.1 RFLP标记技术
• 2.1.2 RAPD标记技术
• 2.1.3 AFLP标记技术
• 2.2 第2代分子标记
• 2.2.1 SSR标记技术
• 2.2.2 ISSR标记技术
• 2.3 第3代分子标记
• 2.3.1 SNP标记技术
• 2.3.2 EST标记技术
• 3 基因差异表达分析方法的研究进展
• 3.1 差异显示PCR法
• 3.2 消减杂交法
• 3.3 基因芯片技术
• 3.4 cDNA—AFLP技术
• 4 cDNA-AFLP技术的特点及应用
• 4.1 cDNA—AFLP的技术特点
• 4.1.1 cDNA—AFLP"假阳性"低,重复性高,可检测低丰度表达的mRNA
• 4.1.2 cDNA-AFLP可准确地反映基因间表达量的区别
• 4.1.3 cDNA—AFLP技术中内切酶与引物的选择
• 4.1.4 cDNA—AFLP可全面获取转录组的表达信息
• 4.2 cDNA-AFLP技术在植物遗传育种上的应用
• 4.2.1 遗传分子标记分析
• 4.2.2 杂种优势遗传机理的研究
• 4.2.3 基因表达特性研究及分离特异表达基因
• 5 本研究的目的和意义
• 第二部分 玉米双低频酶cDNA-AFLP体系的建立
• 1 实验材料
• 1.1 植物材料
• 1.2 生化试剂
• 1.3 相关器具
• 2 实验方法
• 2.1 总RNA提取方法
• 2.1.1 RNAiso Reagent法
• 2.1.2 柱式试剂盒法
• 2.1.3 异硫氰酸胍法
• 2.2 双链cDNA的合成
• 2.3 cDNA-AFLP体系
• 2.3.1 所用接头和引物的DNA序列
• 2.3.2 cDNA的酶切消化
• 2.3.3 接头与酶切产物的连接
• 2.3.4 预扩增反应
• 2.3.5 选择性扩增反应
• 2.3.6 扩增产物的分离
• 3 结果与分析
• 3.1 三种方法提取的RNA检测结果
• 3.2 AFLP预扩增产物检测结果
• 3.3 选择性扩增产物检测结果
• 4 讨论
• 第三部分 玉米cDNA-AFLP表达差异分析
• 1 实验材料
• 1.1 植物材料
• 1.1.1 亲本材料
• 1.1.2 近等基因材料
• 1.2 生化试剂
• 1.3 相关器具
• 2 实验方法
• 2.1 玉米总RNA的提取（RNAiso Reagent法）
• 2.2 双链cDNA的合成
• 2.3 cDNA-AFLP分析
• 2.3.1 所用接头和引物的DNA序列
• 2.3.2 cDNA的酶切消化
• 2.3.3 接头与酶切产物的连接
• 2.3.4 预扩增反应
• 2.3.5 选择性扩增反应
• 2.3.6 扩增产物的分离
• 2.4 差异表达片段的回收及测序
• 2.4.1 目标差异片段从PAGE凝胶中回收
• 2.4.2 再扩增及回收纯化
• 2.4.3 目标片段测序
• 3 结果与分析
• 致谢
• 参考文献
• 附录1
• 附录2
• 附录3