RIG-I样受体在登革病毒诱导的I型干扰素反应中的作用

RIG-I样受体在登革病毒诱导的I型干扰素反应中的作用

论文摘要

登革病毒(Dengue virus,DEN)为单股正链RNA病毒,基因组长约11 kb,为黄病毒科黄病毒属重要成员。自然界中存在4个血清型登革病毒,感染人类后均可导致登革热、登革出血热和登革休克综合征等一系列严重疾病,对热带亚热带地区的公共卫生安全造成重要威胁。目前,登革病毒的致病机理仍不十分清楚,临床上也没有疫苗和特效治疗药物。登革病毒感染人类细胞后,可迅速激活宿主的天然免疫反应,在感染早期限制病毒的复制和传播。Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)和RIG-I样受体(RIG-I-like receptor,RLR)能够侦测和识别入侵的病毒,诱导I型干扰素和促炎症细胞因子产生,在机体的抗病毒天然免疫反应中具有重要作用。TLRs主要表达于免疫细胞和内含体表面,主要在类浆树突细胞等免疫细胞中发挥作用。RLR是一类新发现的模式识别受体,一般在非免疫细胞中识别细胞质中的病毒RNA,诱导I型干扰素的产生。登革病毒主要通过蚊媒叮咬传播,包括朗格汉斯细胞等上皮细胞等被认为是可能的初级靶细胞。在登革病毒感染的人类上皮细胞中,RLR能否以及如何发挥其生物学功能目前并不清楚。本研究以人肺上皮细胞A549作为模型,首先观察了登革病毒诱导的I型干扰素反应,然后进一步通过RNAi和过表达的方法对RIG-I、MDA5等信号分子在病毒诱导的I型干扰素反应中的作用进行了分析,并初步探讨了RIG-I抑制登革病毒的作用机制。主要实验结果包括以下三个部分:一、登革病毒感染可激活RIG-I信号通路,诱导I型干扰素的产生我们首先观察了登革病毒感染A549细胞后诱导IFN-β产生的能力,结果发现登革病毒感染细胞12 h后即可诱导IFN-β的产生,而热灭活病毒不具备诱导IFN-β产生的能力。同时,利用复制子系统进行研究发现,转染登革病毒复制子后同样能够诱导IFN-β的产生,说明病毒基因组的复制是诱导IFN-β的产生的前提条件。进一步通过RT-PCR和Western blotting的方法对RIG-I及其接头蛋白IPS-1的表达水平进行检测,结果发现登革病毒感染后细胞中RIG-I和IPS-1的表达水平均明显上调。在此基础上,我们利用IRF-3和IFN-β启动子控制的CAT报告质粒(PRDIII-I)-CAT和(-110-IFNβ)-CAT定量分析了病毒感染对RIG-I下游信号分子的激活作用,结果发现登革病毒感染可显著增强IRF-3和IFN-β启动子的转录活性。同时,我们分别使用不同血清型和同一血清型不同分离株登革病毒感染A549细胞,结果发现其诱导IFN-β产生的能力未存在显著差异。此外,西尼罗病毒感染A549细胞后,同样能够激活RIG-I分子,诱导IFN-β的产生。上述结果表明,登革病毒在A549细胞中的复制能够激活RIG-I信号通路,并通过一系列级联信号反应诱导I型干扰素的产生;而且,病毒血清型和毒力对病毒诱导的I型干扰素反应并无显著影响。二、MDA5和RIG-I共同参与登革病毒诱导的IFN-β反应为了进一步明确RIG-I在登革病毒感染过程中的作用,我们首先在A549细胞中瞬时表达RIG-I,结果发现全长RIG-I的过表达可显著上调登革病毒诱导的IFN-β反应,而作为显负性突变体的RIG-IC能够下调IFN-β反应。进一步通过siRNA的方法敲除A549细胞中RIG-I基因,结果发现登革病毒感染上述细胞后,IFN-β启动子转录活性仍可被激活,上清中仍可检测到IFN-β的大量产生。这说明,登革病毒感染后I型干扰素反应可能不仅仅由RIG-I信号通路决定。进一步研究发现,登革病毒感染同样可上调MDA5的表达,MDA5在A549细胞中的过表达同样能够激活IFN-β启动子,诱导IFN-β的产生,并呈剂量依赖性。然而MDA5的过表达对登革病毒诱导IFN-β反应并无显著的促进作用,使用siRNA敲除MDA5后发现,登革病毒感染诱导的IFN-β反应并未受MDA5敲除的影响。在此基础上,我们利用shRNA表达载体筛选获得了稳定干扰RIG-I的工程细胞系,登革病毒感染上述细胞后,MDA5的表达明显上调,进一步通过siRNA敲除MDA5,结果发现登革病毒诱导IFN-β产生的能力显著降低。上述结果说明,登革病毒感染上皮细胞后,可同时激活RIG-I和MDA5,RIG-I或MDA5可能存在一种功能上的替代机制,共同参与登革病毒诱导的IFN-β反应,其中RIG-I信号通路可能发挥更主要的作用。三、RIG-I对登革病毒和西尼罗病毒的抑制作用对构建的稳定干扰RIG-I的工程细胞株进行研究发现,登革病毒感染上述细胞后,致细胞病变效应明显增强,上清中子代病毒的产量明显提高。我们进一步通过过表达的方法观察了RIG-I对登革病毒和西尼罗病毒复制的抑制效果,结果发现RIG-I在A549细胞中的过表达能够显著降低子代病毒的产量,并呈剂量依赖性。为明确RIG-I抑制病毒复制的具体作用机制,我们使用IFN-β抗体阻断JAK-STAT信号通路,结果发现RIG-I的过表达仍然对病毒的产量存在明显的抑制作用,说明IFN-β激活的JAK-STAT通路可能不是RIG-I抑制病毒的主要原因,RIG-I本身可能就具有抗病毒作用。我们进一步在A549细胞中表达RIG-I的不同区段,结果发现RIG-I和RIG-IC的过表达对登革病毒均具有抑制作用,说明RIG-I的抗病毒作用可能主要由其C端解旋酶区决定。在此基础上,通过Western blotting的方法对病毒感染早期的蛋白表达水平进行检测发现,RIG-I和RIG-IC的表达使细胞中登革病毒E蛋白的表达水平明显降低。因此,在登革病毒的感染初期,RIG-I很可能不仅诱导I型干扰素的产生,其C端解旋酶区还可通过某种机制抑制病毒蛋白的合成,限制病毒的复制和传播。总之,我们的研究发现,登革病毒感染人类上皮细胞可迅速上调RIG-I和MDA5的表达,RIG-I和MDA5共同参与,并以RIG-I为主诱导IFN-β的产生;此外,RIG-I羧基端能够抑制病毒蛋白的早期合成,对多种蚊媒黄病毒具有抑制作用。这些结果证实了RIG-I/MDA5在病毒感染过程中的重要作用,初步揭示了上皮细胞中登革病毒感染诱导I型干扰素产生的基本过程,为深入探讨病毒-宿主相互作用和抗病毒药物的研制奠定了基础。

论文目录

  • 英文缩略词表
  • 中文摘要
  • 英文摘要
  • 前言
  • 第一部分 登革病毒感染人上皮细胞激活的IFN-β反应
  • 1 材料和方法
  • 2 结果
  • 3 讨论
  • 第二部分 RIG-I 和MDA5 共同参与登革病毒诱导的IFN-β反应
  • 1 材料和方法
  • 2 结果
  • 3 讨论
  • 第三部分 RIG-I 抑制登革病毒的作用机制
  • 1 材料和方法
  • 2 结果
  • 3 讨论
  • 总结
  • 参考文献
  • 在读期间撰写的论著
  • 综述 RIG-I样解旋酶:新发现的模式识别受体
  • 论文 维甲酸诱导基因I信号通路在西尼罗病毒感染中的作用研究
  • 个人简历
  • 致谢
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