大豆疫霉拮抗菌株的筛选、鉴定及拮抗物质的初步分析

论文摘要

大豆疫霉Phytophthora sojae是农业生产上极为重要的植物病原菌之一,由其引起的大豆疫霉根腐病是大豆生产上的毁灭性病害之一。由于疫霉菌与真菌亲缘关系较远,普通杀菌剂对疫霉菌的防治比较困难。筛选具有生防潜力的大豆疫霉拮抗菌,可以为寻找病害措施和设计新的疫病控制策略提供基础。从黑龙江省三个不同地区采集大豆根围土壤样本,并从中分离获得523株分离物,共筛选获得拮抗大豆疫霉的细菌拮抗菌株57株,放线菌拮抗菌株22株,真菌拮抗菌株5株,拮抗菌株占所分离物总数的16.1%。其中,分离到的一株拮抗效果相对最好细菌,命名为B048菌株。经形态学和16SrDNA序列分析,初步鉴定该拮抗细菌为短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）。对峙实验显示,拮抗细菌B048菌株对大豆疫霉的生长抑制率达97.5%；拮抗持久力测定显示,在与大豆疫霉对峙培养21d时抑菌带宽度仍达20.0mm；在盆栽试验中,B048对大豆疫病的防治效果为100%；大豆根部定殖试验显示,处理后60d根部的菌量仍达5.70×105cfu·g-1（根重）。Bacillus pumilus B048发酵液在4℃,经8000rpm,离心20min后,过微后用70%的硫酸铵沉淀,透析后获得仍具有拮抗大豆疫霉活性的无菌粗蛋白。进一步通过实验检测粗蛋白对温度、酸碱度、紫外线照射,结果表明：B048的粗蛋白经100℃,1h处理后,仍是常温处理下抑菌直径的89.3%,对高温具有一定的耐受性,但经121℃、20min处理后,B048粗蛋白完全失去抑菌活性；粗蛋白在pH4-pH10范围内都具有抑菌活性,具有较宽的pH适应范围,但在pH7时抑菌能力最高；B048的抑菌粗蛋白经距离20cm,30W紫外灯照射3h后,抑菌活性是对照的95.7%,提取物对紫外线照射不敏感性。37℃处理6h后,经胃蛋白酶处理的B048菌株的抑菌提取物的活性基本没有变化,而经过蛋白酶K和蛋白酶E处理的提取液活性对大豆疫霉抑菌性几乎完全丧失。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 文献综述
• 1 大豆疫病及大豆疫霉菌的研究概况
• 1.1 大豆疫病在国内外发生概况
• 1.2 大豆疫霉根腐病发生规律
• 1.3 大豆疫霉菌的生物学特性
• 2 大豆疫霉根腐病的主要防治措施
• 2.1 加强检疫工作
• 2.2 应用抗病和耐病品种
• 2.3 药剂防治
• 2.4 栽培控制措施
• 3 拮抗微生物的筛选
• 3.1 拮抗微生物筛选模型
• 3.2 拮抗菌的筛选途径
• 4 拮抗菌防治病害的机制
• 4.1 抗生作用
• 4.2 竞争作用
• 4.3 寄生作用
• 4.4 诱导抗性
• 5 活性物质及其分离技术
• 5.1 拮抗菌产生活性物质的种类
• 5.2 活性物质分离纯化技术
• 6 拮抗菌在生物防治研究中存在的主要问题和发展方向
• 6.1 拮抗菌研究及商业化中存在的主要问题
• 6.2 发展方向
• 引言
• 材料与方法
• 1 土壤微生物的分离
• 1.1 土壤样品
• 1.2 培养基
• 1.3 微生物的分离纯化
• 2 大豆疫霉拮抗菌的筛选
• 2.1 拮抗菌抗菌谱的测定
• 2.2 拮抗菌持久力的测定
• 3 拮抗细菌对大豆疫病控制的盆栽试验
• 4 拮抗细菌在大豆根部的定殖
• 4.1 拮抗菌液处理
• 4.2 拮抗菌在大豆根部的定殖
• 5 拮抗细菌B048菌株的形态观察
• 6 拮抗细菌B048的菌株分子生物学鉴定
• 6.1 菌株总DNA的提取
• 6.2 引物合成
• 6.3 16SRDNA序列PCR扩增反应
• 6.4 大肠杆菌感受态制备
• 6.5 PCR产物与载体的连接
• 6.6 连接产物热激转化及转化子的蓝白斑法筛选
• 6.7 质粒提取方法
• 6.8 测序与同源序列分析
• 7 抑菌物质理化特性
• 7.1 拮抗液的制备
• 7.2 温度稳定性
• 7.3 PH稳定性
• 7.4 紫外线稳定性
• 7.5 蛋白酶稳定性
• 结果与分析
• 1 土壤中大豆疫霉拮抗菌的比例
• 2 拮抗菌对疫霉菌的生长抑制率
• 3 拮抗菌对大豆疫霉的拮抗持久性
• 4 拮抗菌B048对大豆疫病的控制
• 5 拮抗细菌B048菌株在大豆根部的定殖
• 6 拮抗细菌B048菌株的形态
• 7 菌株的分子鉴定
• 7.1 拮抗细菌B048菌株的16S rDNA序列扩增及阳性克隆的鉴定
• 7.2 拮抗细菌B048菌株的16S rDNA序列测定
• 8 抑菌物质理化特性
• 8.1 热稳定性
• 8.2 PH稳定性
• 8.3 紫外线稳定性
• 8.4 蛋白酶稳定性
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介
• 在读期间发表论文