柑桔衰退病毒分子快速检测方法研究

论文摘要

柑桔衰退病是由柑桔衰退病毒（Citrus tristeza virus, CTV）引起的严重危害世界柑桔种植业的一种病害。CTV属于长线形病毒属（Closterovirus）,基因组由含19296个核苷酸的正义单链RNA（+ssRNA）组成。该病能侵染绝大多数商业栽培品种,会导致落叶、落果、树势衰弱和果实生锈斑且品质变劣,严重影响了果品的经济价值,严重时将造成植株死亡。由于缺乏特效的化学防治药剂和抗性品种,因此需要快速准确的诊断鉴定技术为柑桔种植地区的病情监测和柑桔苗木、果品出入境检疫检验服务。传统上柑桔衰退病的检测方法在一定程度上存在着检测周期长、操作复杂、灵敏度不高、危险性大的缺点,不能很好的满足检测工作的要求。自PCR技术发明以来,RT-PCR已经成为病毒检测的一种普遍采用方法,RT-PCR检测技术具有快速、特异、灵敏的特点,可以满足国内外现代植物检疫的要求。研究目的:建立起具有实际应用价值的含有内参照的RT-PCR和先进的荧光定量RT-PCR检测体系,为柑桔衰退病的快速准确鉴定以及病害监测预报提供技术支持。研究内容和结果:①通过比较改进CTAB法、试剂盒法、浸泡法、微柱离心法对提取RNA浓度和纯度的影响,确定微柱离心法能有效地排除植物色素、蛋白质、多糖等物质对RT-PCR反应的干扰,制备适合于RT-PCR的CTV的RNA,减少RT-PCR的假阴性发生率。②优化并建立两种RT-PCR快速检测体系,一是带有内参的常规RT-PCR体系,使用的引物包括CTV引物cquctv9/10和内参引物cqucrpII01/02;另一个是荧光定量RT-PCR体系,使用的引物包括cquctv1/2引物对和TaqMan探针cquctvp1。两种体系的引物和探针是由柑桔衰退病毒的P20基因序列和内参照柑桔RNA polymeraseⅡ基因序列分别设计。③以RT-PCR获得的DNA片段经测序验证后以其为模板,通过体外转录获得大量、高质量RNA作为无害化阳性对照。④以柑桔常见病毒和细菌为对照,验证两种检测方法的特异性发现两个体系的特异性相同;以转录RNA标准品测试两种检测方法的灵敏度发现荧光定量RT-PCR对CTV靶片段RNA的检测灵敏度可达2 fg/25μL,比常规RT-PCR的灵敏度高出2个数量级。⑤对四川、重庆、广西、浙江等地田间样品的实际检测证明内参RT-PCR和荧光定量RT-PCR检测技术的可靠性和准确性。研究结论:利用微柱离心法及阳性标准品,建立了快速、稳定、可靠的定性和定量分子检测体系。从样品的制备到获得检测结果,该体系仅用4h,符合实际检测要求。因此这两个方法可以广泛地用于柑桔苗木CTV检测和对CTV田间动态变化的监控。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 绪论
• 1.1 研究背景
• 1.1.1 柑桔衰退病毒的经济重要性
• 1.1.2 柑桔衰退病毒已有的检测方法
• 1.1.3 植物病害微生物检测技术的发展趋势
• 1.2 研究目的
• 1.3 研究内容和技术路线
• 1.3.1 样品RNA 的快速制备
• 1.3.2 以柑桔聚合酶Ⅱ为内参照的柑桔衰退病常规RT-PCR 检测体系的建立
• 1.3.3 柑桔衰退病荧光定量RT-PCR 检测体系的建立
• 1.4 本研究的创新点
• 2 文献综述
• 2.1 CTV 研究历史与为害
• 2.1.1 CTV 的历史
• 2.1.2 CTV 对柑桔产业造成的为害与损失
• 2.2 CTV 的生物学特征
• 2.2.1 寄主范围
• 2.2.2 株系分化
• 2.2.3 传播途径
• 2.3 分子生物学特性
• 2.3.1 基因组
• 2.3.2 亚基因组
• 2.3.3 衣壳蛋白
• 2.4 CTV 的检测方法
• 2.4.1 指示植物检测
• 2.4.2 内含体的镜检
• 2.4.3 血清学检测
• 2.4.4 分子生物学检测
• 2.5 柑桔衰退病的防治
• 2.5.1 防治策略
• 2.5.2 交叉保护防治柑桔衰退病（MSCP）
• 2.5.3 抗病毒基因工程
• 3 材料和方法
• 3.1 供试材料及采集方法
• 3.2 主要仪器
• 3.3 主要试剂及培养基
• 3.4 样品RNA 的快速制备
• 3.4.1 浸泡法
• 3.4.2 异硫氰酸胍法
• 3.4.3 改进CTAB 法
• 3.4.4 微柱离心法
• 3.4.5 试剂盒提取法
• 3.5 CTV 阳性标准品制备
• 3.6 内参柑桔衰退病毒常规RT-PCR 检测体系的建立
• 3.6.1 柑桔衰退病毒和内参引物设计
• 3.6.2 内参常规RT-PCR 体系的优化
• 3.6.3 内参常规RT-PCR 检测性能测定
• 3.6.4 内参常规 RT-PCR 对田间柑桔苗木CTV 检测
• 3.7 扩增靶片段的克隆与测序
• 3.8 柑桔衰退病毒荧光定量RT-PCR 检测体系的建立
• 3.8.1 引物和TaqMan 探针的设计
• 3.8.2 荧光定量RT-PCR 体系的优化
• 3.8.3 荧光定量RT-PCR 特异性检测
• 3.8.4 荧光定量RT-PCR 灵敏度检测及标准曲线的绘制
• 3.8.5 荧光定量RT-PCR 对田间柑桔苗木CTV 检测
• 4 结果
• 4.1 不同制样方法比较
• 4.2 CTV 阳性标准品制备
• 4.3 内参常规RT-PCR 检测体系
• 4.3.1 内参常规RT-PCR 检测体系的优化
• 4.3.2 内参常规RT-PCR 检测体系性能测定
• 4.3.3 应用内参常规RT-PCR 对田间柑桔苗木CTV 检测
• 4.4 扩增靶片段的克隆与测序结果
• 4.5 荧光定量RT-PCR 检测体系
• 4.5.1 荧光定量 RT-PCR 体系的优化
• 4.5.2 荧光定量RT-PCR 特异性检测
• 4.5.3 荧光定量RT-PCR 灵敏度的检测及标准曲线的绘制
• 4.5.4 应用荧光定量RT-PCR 对田间柑桔苗木CTV 检测
• 5 讨论
• 5.1 不同制样方法对检测结果的影响
• 5.2 引物探针检测性能的比较
• 5.3 两种RT-PCR 检测性能对检测结果的影响
• 5.4 RT-PCR 检测假阳性与假阴性的排除与降低
• 5.5 无害化参照体系的构建与意义
• 5.6 常规RT-PCR 与荧光定量RT-PCR 检测柑桔衰退病毒的比较
• 6 结论与后续工作
• 致谢
• 参考文献
• 附录