一个新的负性调节元件对乙型肝炎病毒启动子调节作用的研究

论文摘要

乙型肝炎病毒（HBV）感染后导致的急、慢性乙型肝炎危害巨大,迄今没有有效的治疗方法。HBV依靠自身严密的调控机制,保证病毒持续复制增殖,从而在体内建立持久感染。HBV表达调控是近年来分子生物学研究的重点之一,各种肝细胞核因子和调节元件通过作用于HBV启动子而发挥转录调节作用。我们在前期研究HBV正链转录体的工作中运用PCR的方法对HBV全基因组进行扫描,通过双荧光素酶报告基因系统、逆转录PCR及实时定量PCR等检测方法,发现HBV基因中的nt453-250为一个新的负性调节元件（NRE）;通过构建该元件的方向及位点突变体,证实了该元件的作用方式无方向及位点依赖性。本课题在前期实验基础上研究该元件对HBV启动子的调节作用,相关研究对于深入了解HBV致病机理及寻找有效的抗病毒治疗方法具有重要意义。本课题通过构建四对分别含HBV启动子片段CP、SP1、SP2和XP的重组质粒,每对质粒中一个为实验组（即在质粒pGL3control的luciferace基因下游插入序列nt250-453）,一个为对照组（即未插入序列nt250-453）,利用双荧光素酶检测系统及RT-PCR方法检测该负性调节元件是否对HBV的四种启动子存在下调作用,选择下调作用最显著的启动子作为下一部分研究对象。研究结果表明,四个实验组中的虫荧光素酶活性均低于相应对照组,且虫荧光素酶基因表达在mRNA水平同样被下调,其中对XP的下调作用尤为明显。在此基础上,通过定点缺失突变的方法在含有HBV（ayw）全基因组,能表达病毒前基因组RNA,但不能表达病毒核心蛋白和P蛋白的质粒LJ196上将nt250-453序列缺失,再将突变质粒与HBV C蛋白和P蛋白的表达质粒LJ96共转染HepG2细胞,构建瞬时转染模型,以保证转染后HBV能在HepG2细胞中复制,在病毒的生活周期中明确其对XP的负性调节作用。利用RT-PCR检测缺失nt250-453序列的病毒X mRNA表达量,Western blot检测HBV X蛋白表达量,我们发现,缺失了nt250-453基因序列的HBV的X mRNA及X蛋白表达量均高于未突变组,从而在HBV上间接验证了HBVnt250-453对XP的负性调节作用。本课题的研究结果证实了nt250-453作为HBV上一个新的负性调节元件对HBV四个启动子的启动作用均有不同程度下调,其中对XP作用最强。并且通过在HBV上构建缺失该序列的瞬时转染模型也证实了它在病毒的生活周期中同样具有对XP的下调作用。而XP转录的0.8kb mRNA的编码产物X蛋白是一种反式激活因子,可以激活多种基因的转录,并与肿瘤发生密切相关,对HBV的复制也有调节作用。该负性调节元件能明显下调XP启动的转录意味着该元件在协调病毒与宿主的关系中发挥着重要作用,这为我们下一步研究提供了新思路。

论文目录

• 符号说明
• 中文摘要
• 英文摘要
• 论文正文：一个新的负性调节元件对乙型肝炎病毒启动子调节作用的研究
• 前言
• 第一部分 报告基因系统上研究负性调节元件对HBV 启动子的调节作用
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第二部分 乙型肝炎病毒上研究负性调节元件对HBV X 启动子的调节作用
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 附件
• 文献综述
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文及参加会议