猪传染性胃肠炎病毒全基因组克隆及N蛋白的表达

论文摘要

猪传染性胃肠炎病毒（transimissible gastroenteriis virus，TGEV）感染2周龄以内仔猪，死亡率可达100％，每年冬季猪传染性胃肠炎（TGE）的流行给养猪业造成了极大的危害。TGEV属于冠状病毒科冠状病毒属，基因组为单股正链RNA，具有感染性，全长约28.5 kb，5′端20 kb编码病毒的复制酶多聚蛋白，3′端约8.3 kb包括通过亚基因组RNA表达的全部基因组，编码4种结构蛋白（S、sM、M、N）和4种非结构蛋白，这些蛋白在病毒的生活周期中都具有重要的作用。对TGEV地方分离株基因组的全面了解和重要蛋白的表达研究有利于揭示该病毒的分子遗传背景和分子致病机制，为TGEV的病原分子生物学、诊断学和基因组学研究奠定基础。本文根据猪传染性胃肠炎病毒的生物学特征，分离1株TGEV毒株，命名为SC-Y株：采用RT-PCR技术分段克隆了SC-Y株基因组全长cDNA；并对重要的结构蛋白-N蛋白进行了表达研究。将疑似感染TGEV的仔猪腹泻病料匀浆，取上清液接种ST细胞，待盲传至第8代，ST细胞可出现明显的细胞病变，收集第8代接毒细胞制备细胞飞片，通过直接荧光抗体技术在接毒的细胞浆中观察到了特异性的免疫荧光，收集接毒细胞制备电镜超薄切片，在透射电子显微镜下观察到了内质网中的病毒样粒子。参照GenBank数据库收录的TO14株、purdue-115株、purdue株和TS株N基因序列设计引物，从接毒细胞中扩增出了预期长度的TGEV N基因片段，将其克隆入PMD18-T载体中，序列测定表明，SC-Y株N基因全长1149 bp，与GenBank中已有的TGEV N基因序列核苷酸同源性均在95.0％以上。根据NCBI已公布的猪传染性胃肠炎病毒的基因组序列，结合多个毒株基因组的限制性内切酶酶谱分析，设计了16对引物，以SC-Y株感染的猪睾丸细胞（ST）总RNA为模板，用RT-PCR方法扩增得到16个cDNA片段，经克隆、测序并拼接后获得了覆盖该病毒基因组全长cDNA序列，SC-Y株基因组全长28590 bp，包含7个阅读框，5′端非编码区长315 nt，3′端非编码区长277 nt，与GenBank中收录的其它6株TGEV分离株的全基因组序列进行比较，结果表明SC-Y与PUR46-MAD株核苷酸同源性最高，达99.7％，TGEV系统进化树显示，SC-Y株与美国Purdue株可能来源于共同的祖先。以8个cDNA阳性质粒为材料，利用相邻片段之间的酶切位点及长链PCR技术获得了3个5 kb左右的cDNA片段，再以感染SC-Y株的ST细胞总RNA为模板，利用RT-PCR扩增了2个6 kb左右cDNA片段，覆盖TGEV基因组的重叠cDNA片段A、B、C、D和E大小分别为6228 bp、5247 bp、5275 bp、6911bp和5115 bp，将它们分别克隆入PTA2载体，为构建猪传染性胃肠炎病毒的全长cDNA克隆提供了条件。应用分子生物学软件分析了猪传染性胃肠炎病毒分离株SC-Y的基因组密码子使用特点，结果显示，TGEV对以T和A结尾的密码子存在轻微的偏爱性，选择真核表达系统，尤其是酵母系统，更适合TGEV基因的表达。各基因片段核苷酸同源性比较表明，SC-Y株的ORF3a和ORF3b与其他分离株相应片段差异明显，ORF1b相对保守，同源性均在98.9％以上。在TGEV四种结构蛋白中，N蛋白的氨基酸变异率最低，为2.14‰。对基因组非编码区二级结构分析结果显示，不同分离株间存在差异。对已构建好的重组质粒pMD18-N通过Bsp1191和XhoⅠ双酶切后，得到TGEV N基因，将其亚克隆入原核表达载体pET-32a（+）中，在IPTG的诱导下，N基因以融合蛋白的形式进行表达，通过重组质粒表达条件的优化，确立了N蛋白表达时的最佳诱导物浓度为0.2 mmol／L，诱导时间为4 h，诱导温度为25℃。以纯化的融合蛋白为抗原包被酶标板，摸索了抗原最佳包被浓度为15μg／ml，抗体稀释度1：40，最适封闭液为5％FBS，血清反应时间为90 min，酶标二抗HRP-SPA的工作浓度为1：5000，反应时间为60 min，底物在室温显色时间为10min。根据已建立的ELISA方法及反应条件，确定阴阳性临界值为0.35，初步建立了以N蛋白为检测抗原的间接ELISA方法。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 文献综述
• 第二章 猪传染性胃肠炎病毒SC-Y株的分离与鉴定
• 1.材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2.结果与分析
• 2.1 病毒培养
• 2.2 免疫荧光抗体鉴定
• 2.3 病毒中和试验
• 2.4 病毒理化试验
• 2.5 电镜观察
• 2.6 PCR扩增实验结果
• 3.讨论
• 3.1 关于病毒的细胞培养
• 3.2 关于免疫荧光试验和电镜观察
• 3.3 关于N基因的特征
• 4.小结
• 第三章 猪传染性胃肠炎病毒SC-Y株全基因组序列测定及长片段cDNA克隆
• 1.猪传染性胃肠炎病毒SC-Y株全基因组序列测定
• 1.1 材料和方法
• 1.2 结果与分析
• 1.2.1 病毒基因组cDNA片段的RT-PCR扩增结果
• 1.2.2 RT-PCR产物的克隆、测序与序列拼接
• 1.2.3 TGEV全基因组序列比较和系统进化树构建
• 2.长片段cDNA克隆
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 方法
• 2.2 结果
• 3.讨论
• 3.1 猪传染性胃肠炎病毒SC-Y株全基因组序列测定
• 3.2 长片段cDNA克隆
• 4.小结
• 第四章 猪传染性胃肠炎病毒全基因组结构特征分析
• 1.材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2.结果与分析
• 2.1 基因组密码子用法特点分析
• 2.2 序列同源性比较
• 2.3 5′端非编码区（5′UTR）结构分析
• 2.4 非结构蛋白分析
• 2.5 结构蛋白分析
• 2.6 3′非编码区（3′UTR）分析
• 3.讨论
• 3.1 基因组密码子偏爱性分析
• 3.2 5′端及3′端非编码区的分析
• 3.3 非结构蛋白的分析
• 3.4 结构蛋白的分析
• 4.小结
• 第五章 猪传染性胃肠炎病毒SC-Y株N基因的原核表达及间接ELISA方法的初步建立
• 1.猪传染性胃肠炎病毒SC-Y株N基因的原核表达及纯化
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 1.3 结果与分析
• 1.3.1 PET-N重组质粒的构建
• 1.3.2 重组表达质粒的诱导表达
• 1.3.3 重组质粒表达条件的优化
• 1.3.4 融合蛋白表达产物Western Blotting检测
• 1.3.5 重组表达蛋白在宿主菌中的分布
• 1.3.6 重组蛋白的纯化
• 2.重组蛋白间接ELISA方法的初步建立
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 抗原和抗体最佳浓度的确定
• 2.3.2 最适封闭液的确定
• 2.3.3 血清最适结合时间的确定
• 2.3.4 酶标二抗稀释倍数和作用时间的确定
• 2.3.5 底物作用时间的确定
• 2.3.6 间接ELISA方法阴阳性临界值的确定
• 2.3.7 特异性试验
• 3.讨论
• 3.1 关于N蛋白的表达系统
• 3.2 关于N蛋白表达条件的优化
• 3.3 关于N蛋白的回收
• 3.4 关于重组质粒的构建及N蛋白的活性
• 3.5 关于ELISA方法
• 4.小结
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文