五种野生稻中包含Pi2/9遗传座位的BAC克隆的筛选与序列初步分析

论文摘要

在水稻Ⅵ号染色体着丝粒区域的Pi2／9遗传座位中至少包含五个稻瘟病抗性基因：Pi2，Pi9，Piz-t，Piz，Pigm。它们都来自不同供体。其中已克隆到的三个基因：Pi2，Pi9，Piz-t编码序列高度同源的NBS-LRR蛋白，对稻瘟病菌都显示出了极强的广谱抗性。为初步分析该遗传座位在AA基因型野生稻（Oryza nivara、Oryza rufipogon）中的分布情况，本文使用同源搜索的方法从上述野生稻BES数据库中获得了三个候选克隆，应用杂交方法对它们进行了鉴定。发现它们的序列高度同源，其中ORBBa0100819的长度最长。初步分析已经获得的BBCC基因型野生稻（Oryza minuta）中可能包含Pi2／9遗传座位的BAC克隆OMBa0030A22和OMBa0045A15的序列后，发现OMBa0030A22只含有Pi2／9遗传座位的同源序列，并未覆盖该遗传座位，OMBa0045A15部分覆盖了该遗传座位。使用同源搜索的方法获得了OMBa0045A15可能的延伸克隆OMBa0024C01，进一步的杂交鉴定发现二者并不具有重叠区域。使用鸟枪法测定了ORBBa0100819和OMBa0024C01的序列，分析发现OMBa0024C01也覆盖了部分Pi2／9遗传座位。使用同源搜索的方法获得了它的延伸克隆OMBa0103F07，进一步分析后发现这两个BAC克隆仍未完全覆盖Oryza minuta中的Pi2／9遗传座位。本文还初步分析了已经完全测序的不同野生稻中包含Pi2／9遗传座位的BAC克隆的序列，发现其中包含的NBS-LRR基因都属于同一进化枝。BBCC基因型野生稻中的Pi2／9遗传座位很可能来源于BB基因型野生稻。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 前言
• 1.1 植物抗病基因简介
• 1.1.1 NBS-LRR
• 1.1.2 LRR-TM
• 1.1.3 STK
• 1.1.4 LRR-TM-STK
• 1.1.5 其他
• 1.2 植物抗病基因的进化
• 1.3 水稻抗病基因的研究进展
• 1.4 Pi2/9遗传座位
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 所用BAC克隆
• 2.1.2 载体
• 2.1.3 菌种
• 2.1.4 主要试剂、酶类和试剂盒
• 2.1.5 主要仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 BAC DNA的小量制备
• 2.2.2 制备好的BAC DNA的酶切
• 2.2.3 杂交
• 2.2.3.1 转膜
• 2.2.3.2 探针标记
• 2.2.3.3 预杂交
• 2.2.3.4 杂交
• 2.2.3.4 洗膜
• 2.2.3.5 信号检测
• 2.2.4 BAC DNA的大量抽提
• 2.2.5 BAC测序亚库的构建
• 2.2.5.1 超声打断
• 2.2.5.2 插入片段的回收与连接
• 2.2.5.3 连接产物的回收与转化
• 2.2.6 亚克隆文库的保存
• 2.2.7 亚克隆DNA的抽提
• 2.2.8 测序反应
• 2.2.8.1 测序PCR
• 2.2.8.2 测序产物的回收及上样
• 2.2.9 序列组装
• 2.2.10 序列空缺的填补
• 2.2.11 序列分析
• 2.2.12 进化树绘制
• 3 结果与分析
• 3.1 Oryza nivara、Oryza rufipogon、Oryza minuta中覆盖Pi2/9遗传座位的BAC克隆的筛选
• 3.1.1 BAC末端序列的同源搜索
• 3.1.2 候选BAC克隆的鉴定
• 3.1.2.1 BAC克隆的完全酶切
• 3.1.2.2 Southern杂交确定代测BAC克隆中NBS-LRR基因的分布情况
• 3.1.2.3 供试BAC克隆的指纹分析
• BBA0100B19和OM_BA0024C01两个BAC克隆测序亚克隆文库的构建与序列测定'>3.2 OR_BBA0100B19和OM_BA0024C01两个BAC克隆测序亚克隆文库的构建与序列测定
• 3.2.1 高纯度BAC DNA的抽提
• 3.2.2 BAC DNA的超声打断和末端补平
• 3.2.3 所需片段的回收及连接
• 3.2.4 所需亚克隆文库大小的估计
• 3.2.5 亚克隆文库测序样品的制备
• 3.2.6 序列测定
• 3.2.7 序列组装
• 3.3 Oryza minuta中Pi2/9遗传座位的延伸
• 3.3.1 延伸克隆的同源搜索
• Ba0178G06和OM_Ba0103F07的鉴定'>3.3.2 BAC克隆OM_Ba0178G06和OM_Ba0103F07的鉴定
• Ba0178G06和OM_Ba0103F07中NBS-LRR基因的分布情况'>3.3.2.1 Southern杂交确定OM_Ba0178G06和OM_Ba0103F07中NBS-LRR基因的分布情况
• Ba0103F07和OM_Ba0024C01的指纹分析'>3.3.2.2 OM_Ba0103F07和OM_Ba0024C01的指纹分析
• Ba0103F07中是否含有NIP基因'>3.3.2.3 杂交确定OM_Ba0103F07中是否含有NIP基因
• 3.4 Oryza punctata中覆盖Pi2/9遗传座位的BAC克隆测序缺口的补平
• 3.5 Oryza punctata、Oryza officinalis、Oryza minuta中Pi2/9遗传座位的初步分析
• 3.5.1 遗传座位中包含的NBS-LRR基因的预测
• 3.5.2 预测出的NBS-LRR基因及基因类似物的进化分析
• 4 讨论
• 4.1 水稻BES和EST数据库的应用
• 4.2 Shot-gun法测定BAC克隆的序列
• 4.3 序列的初步分析
• 5 参考文献
• 6 附录
• 7 致谢