论文摘要
草原龙胆（Eustoma grandiflorum）属龙胆科草本植物，是优良的鲜切花材料，它具有一定的耐盐性，在pH9盐碱地中，植株仍然可以完成生活史。本试验的目的是通过抑制消减杂交技术结合cDNA芯片技术分离草原龙胆盐胁迫诱导基因及耐盐相关基因群。抑制消减文库采用盐处理1 h、3 h、6 h条件下草原龙胆等量混合的mRNA做为tester，未处理条件下草原龙胆的mRNA做为driver。将抑制消减杂交第2次PCR的产物连接至pGEM-T载体中，随后转化到JM109感受态细胞，经蓝白斑筛选、培养后提取质粒DNA。应用测序试剂盒（Amersham）进行质粒DNA测序PCR反应，产物经纯化后在MegaBACE 500测序仪上测序。得出的序列经SeqClust2.1软件去除冗余。结果共得到1153条200bp以上的序列，平均长度为375bp，去除载体和冗余序列，得到658条非重复序列。文库的冗余度为42.9％。将得到的658条序列进行GO分类，在生物学途径中分为有丝分裂检查点、类泛素化蛋白修饰、氧化胁迫反应、转运、电子传递等14类；分子功能中分为过氧化氢酶活性、催化活性、环氧化物酶活性、单氧化酶活性、谷胱甘肽脱氢酶活性等21类；在细胞组件中分为线粒体、叶绿体、过氧化物酶体、乙醛酸循环体、细胞核等10类。以“primer 1”和“primer 2R”为引物，通过PCR的方法将以上获得的658个非重复基因片段从文库的质粒克隆中扩增出来用于芯片的制作。分别用Cy3、Cy5荧光染料标记盐处理和未处理草原龙胆的mRNA，按照3DNA Array900?试剂盒（Genisphere Inc．）的使用说明完成芯片杂交。用ScanArray 4000?芯片扫描仪扫描芯片。通过limma软件包分析，结果显示，显著上调表达的基因为14条，显著下调的基因为16条。其中功能已知的序列为5条，分别为硫氧还蛋白、类泛素化蛋白、缩氨酸转运蛋白、脱氢抗坏血酸还原酶、细胞色素P450。