论文摘要
背景与目的:业已证明动脉粥样硬化是一种慢性炎症性疾病,伴有免疫反应的炎症过程贯穿于动脉粥样硬化的始终。一般说来,免疫系统通过两种互相关联的方式对有害成分进行有效的防御:即先天性和获得性免疫反应。先天性免疫系统介导的免疫反应是第一道防线,主要识别高度保守的病原序列,即病原相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns,PAMPs）,在第一道防御反应中能识别这些PAMPs的受体有TOLL样受体（toll-like receptors,TLRs）和清道夫受体。除了他们在先天性免疫中起关键性作用外,近来还发现TLRs尤其是TOLL样受体4（TLR4）与动脉粥样硬化的发生和发展有关。研究发现在动脉粥样斑块中的内皮细胞、血管平滑肌细胞、血管外膜成纤维细胞和巨噬细胞等的TLR4表达是上调的。斑块中TLR4的表达使人们推测TLR4与动脉硬化性疾病的发生和发展有关。冠状动脉粥样斑块的不稳定是导致临床综合征包括不稳定心绞痛和心肌梗死的病理基础。血管壁的炎症反应是引起斑块不稳定的主要原因。与慢性稳定性心绞痛患者相比,急性冠脉综合征（ acute coronary syndrome, ACS）患者冠状动脉斑块内含有更多的单核巨噬细胞,这些细胞处于激活状态,通过分泌各种细胞因子如肿瘤坏死因子（TNF）-α,白介素（IL）-6等,血管壁的炎症反应加剧,斑块的破裂,进一步引起临床并发症的发生。有证据显示TLR4与粥样斑块的不稳定密切相关。研究发现apoE缺乏的小鼠敲除TLR4基因后主动脉粥样斑块缩小,同时发现TLR4缺乏与斑块的组成改变有关,即斑块内脂质和单核巨噬细胞减少,炎症因子的表达明显降低,这些变化均是斑块结构稳定的指标,由此推断TLR4炎症信号途径参与了斑块不稳定的过程。目前对于循环中单核细胞TLR4的表达与冠状动脉粥样硬化临床表现的关系研究较少。本实验的目的之一是通过对比冠状动脉硬化性心脏病（冠心病）的不同临床类型患者外周血单核细胞TLR4的表达,研究TLR4与粥样斑块进展和破裂之间的关系,为临床防治急性冠脉事件的发生提供治疗途径。他汀类药物即（3-羟基3甲基戊二酰辅酶A还原酶抑制剂）是目前临床应用最广泛的调脂药物,它通过竞争性抑制胆固醇合成的限速酶而降低血中胆固醇浓度。此外它能降低动脉粥样硬化性疾病的发病率和死亡率。但是他汀类药物所带来的临床益处远远大于其降脂作用。他汀类药物抗动脉粥样硬化的作用与其的抗炎作用有关。他汀类药物能抑制核因子（NF）-κB的活性,从而导致促炎细胞因子如TNF-α,IL-6等水平的下降。另外他汀类药物能抑制脂多糖（LPS）刺激的内皮细胞及外周血单核细胞的激活。本实验的目的之一是研究他汀类药物对ACS患者外周血单核细胞TLR4表达及下游炎症因子水平的影响,探讨他汀类药物抗炎稳定斑块的机制。厚朴酚（Mag）是从传统的中草药厚朴中提取的物质。近来发现它具有抗血小板聚集,血管扩张,抗肿瘤及抗炎作用。厚朴酚对慢性炎症性疾病如动脉粥样硬化,哮喘,肿瘤等具有治疗价值。厚朴酚的抗动脉粥样硬化的作用可能与其抗炎作用有关。但对其抗炎的确切机制还不清楚。本实验通过研究厚朴酚对ACS患者外周血单核细胞TLR4的表达和炎症因子水平的影响,来探讨它在动脉粥样硬化性疾病的防治方面的机制,为中药治疗动脉粥样硬化性疾病提供理论依据。方法:（1）将121例参加实验者分为三组:对照组（22例）,稳定性心绞痛（SA）组17例,急性冠脉综合征组（82例）。测定外周血CD14+单核细胞TLR4的表达,血超敏C反应蛋白（hsCRP）的浓度,IL-12和TNF-α的水平。采用流式细胞仪方法测定单核细胞表面TLR4的表达,ELISA法测定IL-12和TNF-α的含量。（2）将41例ACS患者在常规抗缺血治疗的基础上随机分为两组:阿托伐他汀标准治疗组（10mg/d）及强化治疗组（40mg/d）,观察治疗前和治疗一月后血脂、单核细胞表面TLR4的表达,血hsCRP,IL-12和TNF-α水平的变化。分离并培养ACS患者外周血单核细胞,并分以下5组进行体外干预24小时:A:对照组（1640培养基）;B:LPS组（LPS 1mg/L）;C:他汀（Statin）组（阿托伐他汀10μmol/L）;D:LPS+Statin组;E:LPS+Statin+甲羟戊酸组（500μmol/L ）。采用RT-PCR法测定培养单核细胞TLR4mRNA的表达,ELISA法测定细胞上清液中IL-12和TNF-α水平。（3）分离并培养ACS患者外周血单核细胞,并分以下4组进行体外干预24小时:A:对照组（1640培养基）;B:LPS组（LPS 1mg/L）;C:厚朴酚组（20μM）;D:LPS+厚朴酚组。采用RT-PCR法测定培养单核细胞TLR4mRNA的表达,ELISA法测定细胞上清液中IL-12和TNF-α水平。结果:（1）ACS患者外周血CD14+单核细胞表面TLR4的表达明显高于SA患者（p<0.05 ）及对照组（p<0.05）,ACS患者血hsCRP、血清IL-12、TNF-α的浓度均明显高于SA患者及对照组（p<0.05）;hsCRP与TLR4的相关性分析结果是两者明显正相关（r=0.261,p=0.002）。（2）ACS患者经阿托伐他汀治疗一月后外周血CD14+单核细胞表面TLR4的表达明显下调（p<0.05 ）,同时血hsCRP、血清IL-12、TNF-α的浓度也明显下降（p<0.05 ）,阿托伐他汀强化治疗组的作用强于标准治疗组（p<0.05 ）。离体培养,甲羟戊酸可逆转阿托伐他汀对ACS患者外周血单核细胞TLR4mRNA表达的下调（p<0.05 ）,同时也阻断其对TLR4下游炎症因子IL-12和TNF-α水平的下调作用（p<0.05 ）。（3）厚朴酚能下调分离培养的ACS患者外周血单核细胞TLR4mRNA的表达（p<0.05 ）,同时能明显降低其下游炎症因子IL-12和TNF-α水平（p<0.05 ）结论:（1）急性冠脉综合征的发生与循环中单核细胞TLR4表达的上调和血炎症因子水平明显升高有关。（2）他汀类药物抗炎稳定斑块的作用可能与其抑制TLR4炎症通路有关,且通过甲羟戊酸途径起作用。强化调脂较标准调脂治疗能更明显的抑制单核细胞TLR4的表达和炎症因子的释放,说明强化调脂进一步降低临床事件的发生可能与其抑制TLR4炎症通路有关。（3）中药厚朴酚具有抗炎作用。其抗炎抗动脉硬化的机制可能通过抑制TLR4炎症通路其作用。