棉铃虫核型多角体病毒ORF34、ORF44的序列分析与原核表达

论文摘要

棉铃虫核型多角体病毒（HearNPV）可特异性侵染棉铃虫,是理想的棉铃虫生物防治因子。HearNPV的两个分离株C1、G4的基因组全序列已经测定,一些基因的功能已经阐明,ORF34、ORF44是两个功能未知的基因。本研究对ORF34、ORF44基因进行了克隆、序列分析和原核表达研究,首次分析并确认了HearNPV的ORF34、ORF44基因为HearNPV的特有基因,基因表达产物也为后续研究提供了基础。HearNPV ORF34基因全长1080nt,编码359aa,预测编码蛋白分子量为41.2 kDa。序列分析显示,ORF34具有三个杆状病毒早期和晚期基因转录启动子特征序列。分析发现ORF34的推导氨基酸序列中含有1个强跨膜螺旋区域,15个磷酸化位点和1个糖基化位点。除HzNPV ORF34外,未发现与ORF34氨基酸同源性高于30%的基因。构建了pET-34表达载体,并在大肠杆菌BL21中得到了表达,表达的融合蛋白分子量为42kDa,与预测编码蛋白分子量大小相符。序列分析研究结果表明ORF34是HearNPV的一个特有基因。HearNPV ORF44基因全长1137nt,编码378aa,预测编码蛋白分子量为42.7kDa。序列分析显示,ORF44具有双相启动子特征序列,同时兼有杆状病毒早期和晚期基因转录启动子特征序列。分析发现ORF44的推导氨基酸序列中含有1个强跨膜螺旋区域,32个磷酸化位点和4个糖基化位点。除HezeNPV ORF45外,未发现与ORF44氨基酸同源性高于30%的基因。构建了pET-44表达载体,并在大肠杆菌BL21中得到了高效表达,表达的融合蛋白分子量为44 kDa,与预测编码蛋白分子量大小相符。序列分析研究结果表明ORF44是HearNPV的一个特有基因,ORF44融合蛋白的成功表达为进一步制备多克隆抗体,深入研究HearNPV ORF44奠定了基础。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 棉铃虫核型多角体病毒分子生物学研究进展
• 1 杆状病毒的分类
• 2 核型多角体病毒的生活史
• 3 棉铃虫核型多角体病毒分子生物学研究进展
• 3.1 HearNPV 基因组研究
• 3.2 HearNPV 基因功能研究
• 3.2.1 非结构蛋白基因
• 3.2.2 结构蛋白基因
• 第二章 主要研究内容和技术路线
• 1 主要内容
• 1.1 基因序列分析
• 1.2 原核表达
• 2 技术路线
• 2.1 基因序列分析
• 2.2 原核表达
• 第三章 材料与方法
• 1 材料
• 1.1 病毒、菌种和载体
• 1.2 工具酶和试剂盒
• 1.3 其它试剂
• 2 研究方法
• 2.1 PCR 反应
• 2.2 目的片段分离回收
• 2.3 双酶切反应
• 2.4 连接反应
• 2.5 氯化钙制备新鲜的感受态细胞
• 2.6 碱法质粒DNA 小量制备
• 2.7 质粒DNA 转化
• 2.8 外源基因在E.coli 中的表达
• 2.9 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 2.10 Western blot
• 3 常规实验试剂配制
• 3.1 细菌培养基
• 3.2 碱法质粒抽提液
• 3.3 琼脂糖凝胶电泳
• 3.4 SDS-PAGE 试剂
• 3.5 Western blot 试剂
• 3.6 抗生素
• 3.7 RNA 酶（10mg/ml）
• 第四章 HearNPV 基因 ORF34、ORF44 的序列分析
• 1 材料与方法
• 1.1 数据来源
• 1.2 分析方法
• 2 结果与分析
• 2.1 HearNPV ORF34 基因序列分析
• 2.2 HearNPV ORF44 基因序列分析
• 3 讨论
• 第五章 HearNPV 基因 ORF34、ORF44 的原核表达
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 引物设计
• 1.2.2 PCR 反应
• 1.2.3 ORF34、ORF 44 基因的克隆
• 1.2.4 ORF34、ORF 44 基因表达载体的构建
• 1.2.5 ORF34、ORF 44 在大肠杆菌中的表达
• 1.2.6 Western blot 分析
• 2 结果与分析
• 2.1 ORF34、ORF 44 基因的克隆
• 2.1.1 ORF34、ORF 44 基因的扩增
• 2.1.2 ORF34、ORF 44 基因克隆载体的鉴定
• 2.2 ORF34、ORF 44 基因表达载体的鉴定
• 2.3 ORF34、ORF 44 基因的诱导表达
• 3. 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介