提高三分三毛状根中托品烷生物碱含量的研究

论文摘要

托品烷生物碱,包括莨菪碱（Hyoscyamine）、东莨菪碱（Scopolamine）、山莨菪碱（Anisodamine）和樟柳碱（Anisodine）等,广泛存在于曼陀罗（Datura）、莨菪（Hyoscyamus）等茄科植物中。此类生物碱具有较强的抗胆碱生理活性,主要作用于副交感神经系统。莨菪碱和东莨菪碱作为最普遍的抗胆碱药物和解痉镇痛剂被长期广泛应用。近年来又在唐古特山莨菪（Anisodus tanguticus）中分离得到另外两种莨菪烷化合物--山莨菪碱和樟柳碱,同样具有很好的医疗价值和商业需求。药用植物三分三（Anisodus acutangulus）为我国特有的一种茄科多年生草本植物,在云南民间已有悠久历史并且已被列为濒危物种。野生植株中总生物碱含量在1%以上,比一些生产生物碱的茄科植物都要高。三分三毛状根已由本实验室成功诱导获得,本课题在此基础上进行培养基的种类、氮源、碳源、PH值试验,研究不同理化因子对悬浮培养毛状根的生长及次生代谢产物含量的影响。实验结果表明:N6液体培养基不仅有利于毛状根的生长,也对托品烷生物碱的合成有促进作用;4种碳源中,无论是毛状根的增长量还是托品烷生物碱的含量均以蔗糖为碳源时最高;当总氮浓度为90mmol/l时,对毛状根的生长及生物碱的合成效果最佳;毛状根液体培养的最适PH值为6.5。而后,利用甲基茉莉酸（MeJA）、水杨酸（SA）、无水乙醇（EtOH）及银离子（Ag+）4种诱导子对三分三毛状根进行0h、24h、48h、96h不同时间的处理,研究其对毛状根生长情况和托品烷生物碱积累的影响。结果表明:4种诱导子都会对毛状根的生长起到抑制作用,其中甲基茉莉酸阻遏效果最为明显。添加无水乙醇能够有效促进三分三毛状根生物碱的合成,使其生物碱含量显著提高;水杨酸有助于提高山莨菪碱和樟柳碱的含量;而银离子对催化三分三毛状根中生物碱合成作用则并不明显。此外,本研究还利用从三分三植物根部克隆得到的限速酶基因AaPMT1和AaH6H构建表达载体,使用发根农杆菌为介导,分别对三分三外植体进行单基因转化和双基因共转化,并分析目的基因的表达情况和测定托品烷生物碱的含量。结果发现,AaPMT1单转化毛状根中PMT1基因的表达量均高于对照,并且莨菪碱和山莨菪碱的含量有所提高。在AaH6H单转化毛状根中虽然莨菪碱和山莨菪碱的含量与对照相比并没有明显增加,但是由于H6H基因的超表达使东莨菪碱和樟柳碱的含量有了较大的提升。双基因共转化毛状根中生物碱的含量提高更为显著。由此可知,三分三托品烷代谢途径中H6H和PMT关键酶的协同作用推动代谢流向目标产物方向流动,显著提高了次生代谢产物的产量。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩写词表
• 第一章 文献综述
• 1.1 植物次生代谢产物
• 1.2 托品烷生物碱
• 1.2.1 莨菪碱
• 1.2.2 山莨菪碱
• 1.2.3 东莨菪碱
• 1.2.4 樟柳碱
• 1.3 托品烷生物碱合成途径
• 1.3.1 腐胺-N-甲基转移酶（PMT）
• 1.3.2 托品酮还原酶 I（TRI）和托品酮还原酶II（TRII）
• 1.3.3 莨菪碱6β-羟化酶（H6H）
• 1.4 三分三植物性状概述
• 1.5 提高药用植物次生代谢产物的生产途径
• 1.5.1 愈伤组织及细胞培养
• 1.5.2 农杆菌介导遗传转化
• 1.5.3 转基因
• 1.6 影响毛状根生长及其次生代谢产物合成因素
• 1.6.1 氮源和碳源
• 1.6.2 植物激素
• 1.6.3 温度和光照
• 1.6.4 PH 值
• 1.7 课题研究目的及意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 载体及菌种
• 2.1.3 主要仪器设备
• 2.1.4 试剂及药品
• 2.1.5 常用试剂
• 2.2 三分三毛状根培养条件的优化
• 2.2.1 培养基的配制
• 2.2.2 毛状根接种培养
• 2.2.3 毛状根生长状况统计
• 2.2.4 毛状根中托品烷生物碱含量检测
• 2.3 不同诱导子对三分三毛状根的诱导
• 2.3.1 不同诱导子的制备
• 2.3.2 诱导处理
• 2.3.3 生长指标测定
• 2.3.4 托品烷生物碱含量的测定
• 2.4 带有 AaPMT1 和AaH6H 的植物双价表达载体的构建
• 2.4.1 植物双元表达载体pCAMBIA1304+的构成
• ++AaPMT1+AaH6H 的构建'>2.4.2 植物双价表达载体pCAMBIA1304⁺+AaPMT1+AaH6H 的构建
• 2.5 C58C1 介导AaPMT1、AaH6H、AaPMT1+AaH6H 遗传转化三分三
• 2.5.1 发根农杆菌C58C1 感受态细胞的制备
• 2.5.2 发根农杆菌工程菌株的获得
• <sup>++AaPMT1 、pCAMBIA1304^<sup>++AaH6H、pCAMBIA1304^<sup>++AaPMT1+AaH6H 遗传转化三分三'>2.5.3 发根农杆菌 C58C1 介导pCAMBIA1304^<sup>++AaPMT1 、pCAMBIA1304^<sup>++AaH6H、pCAMBIA1304^<sup>++AaPMT1+AaH6H 遗传转化三分三
• 2.6 三分三转AaPMT1、AaH6H、AaPMT1+AaH6H 基因毛状根的获得
• 2.6.1 三分三转基因毛状根PCR 鉴定
• 2.6.2 三分三转基因毛状根液体培养
• 2.6.3 转基因毛状根AaPMT1、AaH6H 表达分析
• 2.6.4 转基因毛状根托品烷生物碱测定
• 第三章 结果与讨论
• 3.1 莨菪碱、山莨菪碱、东莨菪碱和樟柳碱的HPLC 标准曲线
• 3.2 莨菪碱、山莨菪碱、东莨菪碱和樟柳碱标准品和样品 HPLC 图谱
• 3.3 三分三毛状根培养条件的优化
• 3.3.1 不同种类培养基对三分三毛状根生长及托品烷生物碱合成的影响
• 3.3.2 不同碳源对三分三毛状根生长及托品烷生物碱合成的影响
• 3.3.3 不同氮源对三分三毛状根生长及托品烷生物碱合成的影响
• 3.3.4 不同PH 值对三分三毛状根生长及托品烷生物碱合成的影响
• 3.4 不同诱导子对三分三毛状根生长和托品烷生物碱含量积累的影响
• 3.4.1 诱导子对三分三毛状根生长势的影响
• 3.4.2 三分三毛状根诱导后托品烷生物碱含量积累
• ++AaPMT1+AaH6H 的构建'>3.5 植物双价表达载体pCAMBIA1304⁺+AaPMT1+AaH6H 的构建
• 3.6 三分三的遗传转化
• 3.6.1 AaPMT1 单基因的转化
• 3.6.2 AaH6H 单基因的转化
• 3.6.3 AaPMT1+AaH6H 双基因的转化
• 3.7 转基因毛状根基因表达分析
• 3.7.1 AaPMT1 转基因毛状根中 AaPMT1 表达分析以及含量测定
• 3.7.2 AaH6H 转基因毛状根中 AaH6H 表达分析以及生物碱含量测定
• 3.7.3 双基因转化毛状根AaPMT1、AaH6H 表达分析以及生物碱含量测定
• 第四章 总结与展望
• 4.1 研究结论
• 4.2 后续研究方向
• 参考文献
• 硕士期间发表的论文及成果
• 致谢