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鸡白细胞介素6基因的克隆及对新城疫LaSota疫苗的免疫增强作用研究

2020-12-02阅读(665)

鸡白细胞介素6基因的克隆及对新城疫LaSota疫苗的免疫增强作用研究

论文摘要

根据GenBank中鸡白介素6（ChIL-6）基因序列（AJ309540）设计一对引物，采用RT-PCR方法从ConA诱导的四川雅安土鸡脾淋巴细胞总RNA中扩增出约600bp的基因片段，克隆到pMD18-T载体，进行序列测定和分析。结果显示：该克隆的cDNA全长603bp，包含了鸡IL-6基因的开放阅读框585bp，编码195个氨基酸残基，与GenBank上仅有的1条鸡IL-6序列（AJ309540）的同源性为100％。生物信息学分析表明，该基因编码的蛋白具有亲水性，有很强的抗原性，有3个蛋白激酶C磷酸化位点，2个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点。该基因经Xho I和Xba I双酶切后，插入同样经Xho I和Xba I双酶切真核表达载体pCI-neo中，构建出真核表达质粒pCI-IL-6，通过免疫试验和攻毒试验观察其对新城疫LaSota疫苗的免疫增强作用。将21日龄非免疫健康雏鸡100只随机分为5组，肌肉免疫（LaSota疫苗组、pCI-IL-6+LaSota疫苗组、pCI-IL-6组、pCI-neo组和PBS组）。通过检测HI抗体、CD4+、CD8+和CD3+T淋巴细胞百分含量，分析pCI-IL-6对LaSota疫苗的免疫佐剂效应。各组试验鸡在免疫接种后的不同时期，用血凝抑制试验（HI）测定NDV抗体，结果表明，pCI-IL-6和LaSota疫苗联合免疫组从第14天起就一直高于LaSota疫苗单独免疫组，在第14、21、35天时差异显著（P<0．05），在28天时差异极显著（P<0．01）；pCI-IL-6和LaSota疫苗联合免疫组与其它试验组比较差异均极显著（P<0．01）。用流式细胞仪检测外周血代表T细胞亚群的CD4+、CD8+和CD3+。CD4+T淋巴细胞百分含量检测结果表明，pCI-IL-6+LaSota疫苗联合免疫组与LaSota疫苗单独免疫组相比，在14天出现差异显著（P<0．05），在21、28天差异极显著（P<0．01）；pCI-IL-6+LaSota疫苗与其它试验组比较均差异极显著（P<0．01）。CD8+T淋巴细胞百分含量检测结果表明，pCI-IL-6+LaSota疫苗联合免疫组和LaSota疫苗单独免疫组相比，在免疫后14天出现差异极显著（P<0．01），第28天差异显著（P<0．05）；14天时与其它试验组比较均差异极显著（P<0．01）。CD3+T淋巴细胞百分含量测定结果表明，LaSota疫苗联合佐剂pCI-IL-6组与单独LaSota疫苗组比较在7、28、35天差异显著（P<0．05），在14、21天时差异极显著（P<0．01）；与其它试验组比较均差异极显著（P<0．01）。在免疫后35天进行攻毒，pCI-IL-6和LaSota疫苗联合免疫组的保护率为89．5％，而LaSota疫苗单独免疫组的保护率为76．5％。表明，pCI-IL-6能提高新城疫LaSota疫苗的免疫效果，能提高新城疫疫苗免疫的细胞和体液免疫水平及攻毒保护率。鸡IL-6真核质粒免疫佐剂效应的研究国内外尚未见报道。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 1 前言
  • 1.1 新城疫的流行现状和存在的问题
  • 1.2 鸡细胞因子作为免疫增强剂的研究进展
  • 1.3 白介素6的研究进展
  • 1.4 本研究的目的和意义
  • 2 试验材料和仪器
  • 2.1 实验动物、疫苗及攻毒保护实验所用毒株
  • 2.1.1 实验动物
  • 2.1.2 疫苗
  • 2.1.3 攻毒试验所用毒株
  • 2.2 宿主菌和载体
  • 2.3 化学试剂
  • 2.4 分子生物学试剂
  • 2.5 主要仪器
  • 2.6 培养基及溶液的配制
  • 2.7 其它
  • 3 试验方法
  • 3.1 引物设计
  • 3.2 鸡脾淋巴细胞分离和培养
  • 3.3 RNA的提取
  • 3.4 鸡IL-6基因的RT-PCR扩增及鉴定
  • 3.4.1 鸡IL-6基因的RT-PCR
  • 3.4.2 鸡IL-6基因片段的回收
  • 3.4.3 鸡IL-6基因与pMD18-T载体连接
  • 3.4.4 连接产物的转化
  • 3.4.5 重组质粒ChIL-6的筛选和初步鉴定
  • 3.5 鸡IL-6基因的序列测定与遗传分析
  • 3.6 生物信息学分析
  • 3.7 鸡IL-6基因真核表达质粒的构建及鉴定
  • 3.7.1 鸡IL-6 DNA片段的回收
  • 3.7.2 真核表达载体pCI-neo的制备
  • 3.7.3 ChIL-6 DNA片段和真核表达载体pCI-neo的连接
  • 3.7.4 pCI-IL-6重组真核表达质粒的筛选及鉴定
  • 3.8 pCI-IL-6真核表达质粒的大量制备
  • 3.9 动物试验及分组
  • 3.10 新城疫HI抗体的测定
  • 3.10.1 1%鸡红细胞的制备
  • 3.10.2 微量血凝试验（HA）
  • 3.10.3 微量血凝抑制试验（HI）
  • +、CD4+、CD8+T淋巴细胞的测定'>3.11 CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞的测定
  • 3.12 数据分析
  • 3.13 攻毒试验
  • 4 试验结果
  • 4.1 鸡外周血淋巴细胞总RNA的提取及完整性鉴定
  • 4.2 鸡IL-6基因的RT-PCR
  • 4.3 鸡IL-6基因的菌落PCR及酶切鉴定
  • 4.3.1 菌落PCR
  • 4.3.2 ChIL-6重组质粒酶切鉴定
  • 4.4 鸡IL-6基因的序列测定与遗传分析
  • 4.5 生物信息学分析
  • 4.5.1 亲水性、抗原表位的预测
  • 4.5.2 蛋白质二级结构的预测
  • 4.6 鸡IL-6基因真核表达质粒的构建与鉴定
  • 4.7 动物免疫试验
  • 4.8 HI抗体的测定
  • +、CD8+、CD3+T淋巴细胞测定'>4.9 CD4+、CD8+、CD3+T淋巴细胞测定
  • +T淋巴细胞亚群数量的动态变化'>4.9.1 分子免疫佐剂pCI-IL-6联合新城疫LaSota疫苗免疫后CD4+T淋巴细胞亚群数量的动态变化
  • +T淋巴细胞亚群数量的动态变化'>4.9.2 分子免疫佐剂pCI-IL-6联合新城疫LaSota疫苗免疫后CD8+T淋巴细胞亚群数量的动态变化
  • +T淋巴细胞亚群数量的动态变化'>4.9.3 分子免疫佐剂pCI-IL-6联合新城疫LaSota疫苗免疫后CD3+T淋巴细胞亚群数量的动态变化
  • 4.10 攻毒试验结果
  • 5 讨论
  • 5.1 鸡IL-6基因的RT-PCR
  • 5.2 鸡IL-6基因的序列分析
  • 5.3 鸡IL-6基因真核表达质粒的构建
  • 5.4 采用流式细胞技术测定T淋巴细胞亚群的动态变化
  • 5.5 pCI-IL-6真核表达质粒对新城疫LaSota疫苗免疫增强作用
  • 6 结论
  • 参考文献
  • 致谢
  • 在读期间发表论文

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