肌肉细胞特异性增强因子2A（MEF2A）在斑马鱼心脏和体节发育中的作用

论文摘要

肌肉细胞特异性增强因子2基因（Myocyte specific-enhancer factor 2，MEF2）广泛存在于果蝇、斑马鱼、小鼠和人类中。在小鼠和人类中，MEF2基因家族至少存在4个成员：MEF2A，MEF2B，MEF2C和MEF2D。其中MEF2A在骨骼肌细胞的发育、分化过程中发挥着关键作用。人类家系遗传分析表明突变的MEF2A是冠状动脉粥样硬化的致病基因之一，这一致病基因的发现为研究冠心病的发病机理、开发预防和治疗相关的新药具有重要价值。分子遗传学筛查发现冠心病患者中近2％可能携带有MEF2A突变基因，这就提示MEF2A基因突变与冠心病及心梗有直接相关性，MEF2A基因在冠心病发病过程中有重要功能，但具体机制尚不清楚。最近，上述结论引起争议。MEF2A基因敲除小鼠出生后死于猝死，MEF2A杂合性突变体小鼠出生后发育正常，MEF2A-/-小鼠死因不明。模式生物作为研究基因功能的一种新型的研究方法，斑马鱼胚胎透明、体外发育、个体小、繁殖率高、产卵时间长、以及鱼种发育遗传背景清晰等优点使其正成为研究脊椎动物发育生物学、发育遗传学的理想模式生物。斑马鱼属于脊椎动物，其心血管、血液、消化道、肝脏、肾脏以及视觉系统与人类相应系统有许多共同特点。用该模型阐明早期发育、器官形成、系统生理学、药理学和复杂疾病等问题均切实可行。2000年，Nasevicius等提出了注射吗啡啉修饰性寡核苷酸可获得基因下调斑马鱼。吗啡啉有抑制翻译的起始，减少传统反义寡核苷酸非特异性的效应。注射吗啡啉能够产生以往证实的基因突变的拟表型，有助于确定未知功能的基因。吗啡啉寡核苷酸正在成为快速、高效的基因敲除方法，使经典反向遗传学方法应用于斑马鱼。斑马鱼具有许多适合心血管系统疾病研究的优势，斑马鱼的心脏容易观察和便于操作，更有意义的是，由于它的胚胎小，可以不依赖于有功能的心血管系统，甚至在整个心血管循环缺失的情况下，它仍然能通过对氧的被动运输而生存，继续发育一段时间，这就可以活体观察心血管系统有严重缺陷的突变体，为心血管发育遗传学研究提供极为有利条件亡，此外，斑马鱼与人类的心脏发育具有极其相似的基因调控途径，因此进行斑马鱼的心脏发育机制研究，对揭示人类心脏发育的基因调控机理有重要的启示意义，这使得斑马鱼成为进行心脏发育生物学研究的重要模式动物之一，极大地推动心血管疾病发病机制的研究。应用斑马鱼正向遗传学（forward genetics）研究已鉴定了多个影响心脏收缩功能的突变体。突变体weak atrium心房停止跳动，而心室正常节律性收缩；silent heart是心脏收缩功能缺陷最严重的突变体，其心房和心室都停止跳动，但心房和心室外形发育正常；突变体quiet heart心房和心室几乎停止跳动，但心房和心室外形发育正常；突变体stretched心房和心室跳动但无血液循环，胚胎发育到48小时时，纯合子突变体stretched严重水肿，整个心脏形成针样结构。定位克隆结果证明上述突变基因是形成肌节的结构蛋白质的相应编码基因，心肌肌原纤维由粗、细肌丝规律排列组成，心肌肌节是心肌收缩的基本元件，肌丝的滑动是心肌收缩的动力基础。构成肌节的结构蛋白质突变可导致扩张型心肌病或肥厚型心肌病，甚至心力衰竭。到目前为止，在大规模斑马鱼遗传筛选中，还没有突变体的突变基因遗传定位到MEF2A位点。BMP-2是参与胚胎早期分化发育的又一个因子，有趣的是，发育后期机体BMP-2基因仍有表达，提示BMP-2基因在发育后期仍有生物学功能，但BMP-2基因敲除小鼠在早期胚胎7.0-10.5天时就死亡，妨碍了探讨BMP-2基因在发育后期的功能。到目前为止，还没有直接的遗传学证据表明BMP-2调节心脏收缩。本研究得利于斑马鱼在心血管发育遗传学中的优势，BMP-2基因敲除小鼠在早期胚胎死亡，所以用小鼠模型研究发育后期BMP-2基因功能很困难。相反，斑马鱼胚胎发育并不完全依赖有功能的心血管系统，环境中的氧可以扩散进入胚胎机体。这就为探讨BMP-2基因功能提供可能。我们实验证明，心肌细胞可以合成并分泌BMP-2，BMP-2不仅是背腹分化所必需的，也是维持心脏收缩所不可缺的。新生大鼠心肌细胞模型作为一种体外实验研究模型，可以更方便地从细胞和分子水平研究心血管疾病的发病机制，成为心血管疾病研究的一项主要手段和基本技术。体节发育过程受多种遗传因子调节，有趣的是斑马鱼前6个体节每20分钟形成1个体节，而后24个体节每30分钟形成1个体节，表明前部体节和后部体节发育机理不完全相同。斑马鱼大规模遗传筛选获得多个体节发育缺陷突变体，还没有突变体遗传定位到MEF2A位点。第一部分MEF2A在斑马鱼心脏发育中的作用本部分研究拟利用斑马鱼在心血管发育遗传学优势，探讨MEF2A基因在斑马鱼心脏发育中的作用。首先，利用RT-PCR，胚胎整体原位杂交和MEF2A：GFP转基因斑马鱼的动态分析等多种手段探讨MEF2A在胚胎发育中的表达模式，表明MEF2A在斑马鱼胚胎发育过程中在心脏及体节中有表达，在心脏中的表达提示MEF2A在心脏发育中有某种特定功能。其后，利用吗啡啉修饰的寡核苷酸技术在整体水平下调（knock-down）MEF2A基因的表达，探讨其异常表型及其机制。发现：1．胚胎发育到48小时时，胚胎心脏形态发生正常。但心脏收缩频率降低，心室收缩指数降低，心肌收缩力降低，整体动物实验提示MEF2A参与心脏的收缩功能。2．心肌电镜结果提示MEF2A参与心肌肌节的组装，MEF2A功能下调导致心肌肌节的组装紊乱，细胞水平证明MEF2A的功能完整是心脏正常收缩所必需的。3．Real-Time PCR、原位免疫荧光实验技术显示MEF2A的表达下调能导致参与心肌收缩基因的表达异常，这些收缩基因的表达产物收缩蛋白是形成心肌肌节的基本元件，是参与心肌收缩的动力装置。从分子水平证明MEF2A参与心脏的收缩功能。第二部分BMP2作用于MEF2A上游调节心脏收缩第一部分我们提供了MEF2A调节心脏收缩的功能的遗传学基础，MEF2A作为一个转录因子，其上游的调节机制还很少有报道。本部分研究综合利用斑马鱼和心肌细胞模型，首先，分析了斑马鱼、大鼠和人的BMP-2和MEF2A高度同源；其次，证明BMP-2和MEF2A在胚胎心脏中共同表达；再次，提供BMP2调节心脏收缩的遗传学证据；第四，用生化手段证明BMP-2可以调控新生大鼠心室心肌细胞MEF-2A的表达；第五，用功能恢复手段证明MEF2A作用于BMP2下游调节心脏收缩；第六，提出BMP2-MEF2A通路调节心脏收缩的模型，分析靶向BMP2-MEF2A通路可以为心力衰竭的防治提供新的手段。第三部分MEF2A在斑马鱼体节发育中的作用第一部分我们证明MEF2A在斑马鱼胚胎发育过程中在体节中有表达，在体节中的表达提示MEF2A在体节发育中有某种特定功能。体节发育过程受多种遗传因子调节，有趣的是斑马鱼前6个体节每20分钟形成1个，而后24个体节每30分钟形成1个，表明前部体节和后部体节发育机理不完全相同。斑马鱼大规模遗传筛选获得多个体节发育缺陷突变体，还没有突变体遗传定位到MEF2A位点。本部分研究利用斑马鱼在体外发育、胚胎透明、发育快速的特点，探讨MEF2A基因在斑马鱼在体节的作用。利用吗啡啉修饰的寡核苷酸技术在整体水平下调MEF2A基因的表达，探讨体节发育缺陷表型其异常表型，发现1．斑马鱼胚胎MEF2A下调后尾部向下弯曲，形成U型的后部体节；2．MEF2A是Hedgehog通路所必需的，尽管MEF2A不影响shh，ehh的表达；3．MEF2A下调后导致后部体节凋亡增加；4．Hedgehog信号抑制MEF2A的表达；5．利用表达谱基因芯片技术探讨MEF2A基因下调后的基因表达改变，为研究MEF2A下游的靶基因提供的源泉。上述实验证明MEF2A是斑马鱼后部体节发育所必需的第四部分Wortmannin诱导斑马鱼“双心畸形”本论文第一、二部分我们证明BMP-2及MEF2A调节心脏收缩的功能，等报道磷脂酰肌醇激酶3（PI-3-K）可以负性调节离体培养心肌细胞的收缩，我们想探讨PI-3-K能否调节斑马鱼胚胎心脏收缩，与BMP-2及MEF2A之间有无某种调节作用，我们用一种很常用的PI-3-K的抑制剂wortmannin诱导斑马鱼胚胎，结果发现处理的胚胎“双心畸形”的表型，引起我们的关注。本部分我们首次报道wortmannin诱导斑马鱼胚胎“双心畸形”。首先用原位免疫荧光方法及整体原位杂交的方法证明wortmannin可诱导二个独立的心脏，再次，证明wortmannin诱导斑马鱼产生“双心畸形”呈明显的剂量—效应关系并存在特定的“时间窗”，最后，我们证明wortmannin通过PI-3-K和肌球蛋白轻链激酶（MLCK）以外的信号途径导致斑马鱼“双心畸形。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 引言
• 第一部分 MEF2A在斑马鱼心脏发育中的作用
• 引言
• 第一节 MEF2A在斑马鱼胚胎发育过程中的表达模式
• 1.材料和方法
• 2.结果
• 第二节 MEF2A是斑马鱼胚胎心脏收缩所必需的
• 1.材料和方法
• 2.结果
• 3.讨论
• 4.小结
• 第二部分 BMP2作用于MEF2A上游调节心脏收缩
• 引言
• 1.材料和方法
• 2.结果
• 3.讨论
• 4.小结
• 第三部分 MEF2A在斑马鱼体节发育中的作用
• 引言
• 1.材料和方法
• 2.结果
• 3.讨论
• 4.小结
• 第四部分 Wortmannin诱导斑马鱼"双心畸形"
• 引言
• 1.材料和方法
• 2.结果
• 3.讨论
• 4.小结
• 全文总结与展望
• 全文参考文献
• 综述
• 发表论文、申请专利、参加会议及获奖情况
• 致谢
• 附录