食物过敏大鼠肠道屏障功能的变化

论文摘要

近年来,食物过敏（Food allergy, FA）的发病率呈逐步上升趋势,已被视为一种严重的公共卫生问题。但到目前为止,FA的发生机制还没有完全被阐明,尤其是食物过敏过程中肠粘膜屏障功能的损伤机制还不清楚。在机械和生化等条件的作用下,肠粘膜屏障的完整性有可能遭到破坏,使TJs发生结构重排或缺失,进而导致肠道通透性的异常改变。研究表明,肠道通透性的异常改变是FA发生的一个重要诱因。但对于FA过程中肠道屏障功能变化的分子基础,国内外尚未见深入的研究报道。因此,研究食物过敏时肠道屏障功能的变化,并寻找与FA相关的肠道紧密连接分子显得尤为重要。目的研究食物过敏时肠道屏障功能的变化,并寻找与食物过敏相关的肠道紧密连接结构基因,为RA的预防、诊断和治疗提供新的理论基础。方法构建挪威棕色（Brown Norway, BN）大鼠的食物过敏动物模型：实验组每天给予1mg/mL的卵清蛋白（Ovalbumin, OVA） 1mL灌胃；对照组每天给予0.1mmol/L的PBS 1mL灌胃,共6周。建模期间,每7天1次分别给予每只大鼠一定量的乳果糖（Lactulose, L）和甘露醇（Mannitol, M）灌胃,收集24h尿液,通过高效液相色谱仪（High performance liquid chromatography, HPLC）检测并计算尿液中L/M比值,动态检测肠道通透性的变化。同时每7天1次分别从每只大鼠的尾静脉取血,通过ELISA方法检测血清中OVA特异性IgE、IgG含量的动态变化。建模成功后,每组选取5只大鼠,经乙醚麻醉处死后,分别剪取十二指肠、空肠上段、空肠下段、回肠上段及回肠下段各1cm。经固定、包埋、切片、染色,光镜下观察肠道各段的病理变化,并对回肠部位的紧密连接结构进行电镜形态学观察。同时于建模成功后,每组随机选择3只动物,处死后剪取整个回肠组织,运用基因芯片技术进行全基因表达变化的分析。经基因芯片检测后,选取6种关键基因：ZO-1、Occludin、Claudin-2、8、9、15进行实时荧光定量PCR验证其在两个组中的表达变化。结果1.动物模型的评价17只实验组BN大鼠中,根据建模成功的评判指标,11只建模成功,占总数的64.7%。血清OVA-IgE检测结果显示：不同时间测量的OVA-IgE含量差异有统计学意义（F=746.523,P<0.001）；测量时间和组别间有交互作用（F=134.238,P<0.001）；组间效应比较分析也显示两组间差异有统计学意义（F=165.464,P<0.001）；每个时间点两组比较,第6周两组OVA-IgE差异有统计学意义（F=686.37,P<0.001）。血清OVA-IgG检测结果显示：不同时间测量的OVA-IgG含量差异有统计学意义（F=30.797,P<0.001）。测量时间和组别间有交互作用（F=42.274,P<0.001）；组间效应比较分析也显示两组间差异有统计学意义（F=221.774,P<0.001）。每个时间点两组比较,3-6周两组OVA-IgG差异均有统计学意义（F分别为38.96,93.30,155.08,454.70；P值均小于0.001）。光镜下观察肠组织结构：对照组肠绒毛排列整齐、结构清晰完整,而实验组十二指肠至回肠下段均不同程度地出现肠绒毛结构损伤、缺失和固有层大量炎性细胞浸润的现象。2.肠道通透性的变化尿液中L/M结果显示：不同时间测量的L/M含量差异有统计学意义（F=1855,P<0.001）。测量时间和组别间有交互作用（F=394.494,P<0.001）。组间效应比较分析也显示两组间差异有统计学意义（F=2127,P<0.001）。每个时间点两组比较,2-6周两组差异均有统计学意义（F值分别为：78.37,1121,937.94,3238,3290；P值均小于0.001）。3.肠道TJ结构的形态学及相关分子变化经透射电镜观察,对照组回肠的微绒毛排列整齐,结构完整,细胞间TJs相互融合,各种细胞器排列规则。而实验组回肠部位绒毛肿胀、脱落,细胞间紧密连接结构扩大,细胞结构紊乱,细胞器出现明显变形破坏。基因芯片检测发现,食物过敏大鼠肠道出现明显变化的TJ结构基因主要有：Claudin-2、6、8、9、11、15、18、22。其中Claudin-9、15、18、22上调,其它下调。而ZO-1和Occludin的mRNA水平与对照组相比没有明显变化。选取的6种基因经荧光定量PCR分析,上调的基因为：Claudin-9;下调的基因为：ZO-1、Claudin-2、Claudin-8、Claudin-15;其中Occludin在两组样本中表达无明显变化。结论1.食物过敏时抗原特异性的IgG和IgE含量均升高,IgG的升高发生在食物过敏早期。2.食物过敏大鼠从十二指肠到回肠下段均不同程度地发生了炎症变化。3.致敏大鼠肠道通透性的增加发生在食物过敏早期。4.与食物过敏相关的TJ结构基因主要为跨膜蛋白Claudins。它们在食物过敏中的表达呈双向分歧：其中Claudin-9、15、18、22上调,Claudin-2、6、8、11下调。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 图表索引
• 引言
• 第一部分 食物过敏动物模型的建立及评价
• 1 材料
• 1.1 建模动物
• 1.2 皮肤被动过敏试验（Passive cutaneous anaphylaxis,PCA）动物
• 1.3 主要仪器设备
• 1.4 主要试剂及材料
• 1.5 主要试剂配方
• 2 方法
• 2.1 实验动物分组
• 2.2 动物模型
• 2.3 评价指标
• 2.3.1 血清OVA-IgE检测
• 2.3.2 血清OVA-IgG检测
• 2.3.3 PCA试验
• 2.3.4 肠道病理切片观察
• 2.4 数据的统计分析
• 3 结果
• 3.1 模型的评价
• 3.2 血清OVA-IgE抗体检测结果
• 3.2.1 时间、组别因素以及时间和组别之间的交互作用分析
• 3.2.2 每个时间点上两个组之间的差异比较结果
• 3.3 血清OVA-IgG抗体检测结果
• 3.3.1 时间、组别因素以及时间和组别之间的交互作用分析
• 3.3.2 每个时间点上两个组之间的差异比较结果
• 3.4 PCA实验结果
• 3.5 肠道病理切片结果图
• 3.5.1 十二指肠形态结构观察
• 3.5.2 空肠上段形态结构观察
• 3.5.3 空肠下段形态结构观察
• 3.5.4 回肠上段形态结构观察
• 3.5.5 回肠下段形态结构观察
• 4 讨论
• 5 结论
• 第二部分 食物过敏大鼠肠道通透性的变化研究
• 1 材料
• 1.1 主要仪器设备
• 1.2 主要试剂及材料
• 2 方法
• 2.1 肠道通透性的检测
• 2.1 1 双糖灌胃
• 2.1.2 收集尿液
• 2.1.3 尿L/M比值测定
• 2.1.4 标准曲线的制作
• 2.2 血清中OVA抗原含量的检测
• 2.3 数据的统计分析
• 3 结果
• 3.1 肠道通透性的检测
• 3.1.1 乳果糖的标准曲线图
• 3.1.2 甘露醇的标准曲线图
• 3.1.3 BN大鼠肠道通透性的动态变化检测
• 3.2 血清中OVA的抗原含量检测
• 4 讨论
• 5 结论
• 第三部分 食物过敏大鼠肠道TJ结构形态学及相关分子变化的研究
• 1 材料
• 1.1 主要仪器设备
• 1.2 主要试剂及材料
• 2 方法
• 2.1 肠道TJ结构的电镜观察
• 2.2 基因芯片检测整个肠道TJ结构所有结构蛋白的变化情况
• 2.3 选择变化明显的结构蛋白进行验证
• 2.3.1 肠段总RNA提取
• 2.3.2 cDNA的合成
• 2.3.3 cDNA的质量检测
• 2.3.4 实时荧光定量PCR
• 2.4 数据的统计分析
• 3 结果
• 3.1 肠道TJ结构的电镜观察
• 3.2 基因芯片检测结果
• 3.2.1 表达变化的基因列表
• 3.2.2 TJ蛋白信号通路变化
• 3.3 TJ相关蛋白的mRNA水平检测
• 3.3.1 引物设计
• 3.3.2 RNA提取的鉴定
• 3.3.3 cDNA合成质量的检测
• 3.3.4 目的基因扩增片段结果检测
• 3.3.5 荧光定量PCR检测结果
• 4 讨论
• 5 结论
• 参考文献
• 肠道屏障功能与疾病的研究进展
• 参考文献
• 个人简历
• 攻读硕士学位期间发表论文情况
• 致谢