脂联素对乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的影响及其机制的探讨

论文摘要

目的:通过培养SD大鼠乳鼠心室肌细胞,建立缺氧/复氧模型,以模拟在体心肌缺血/再灌注损伤,观察脂联素对心肌细胞缺氧/复氧损伤的影响,并探讨其可能的作用机制。方法:采用胰蛋白酶消化法,结合差速贴壁法和化学试剂抑制法分离纯化1～3天SD大鼠心室肌细胞,分离的心肌细胞培养于含20%胎牛血清的DMEM培养基中。使用倒置显微镜观察细胞生长状态和自发搏动情况,并通过α-肌动蛋白和心肌特异性肌钙蛋白cTnT免疫荧光法对培养心肌细胞进行鉴定。选用培养72小时的单层心肌细胞进行实验,随机分为6组:①空白对照组:心肌细胞正常培养;②脂联素组（APN组）:加入终浓度为30μg/ml的脂联素与心肌细胞共孵育24小时;③缺氧/复氧组（H/R组）:用缺氧液置换正常细胞培养液,将培养板置于纯氮持续通气的密闭容器中（37℃）3小时造成缺氧,再用复氧液置换缺氧液,以纯氧孵育1小时（37℃）造成再复氧;④缺氧/复氧+脂联素组（H/R+APN组）:终浓度为30μg/ml的脂联素与心肌细胞孵育24h后,进行缺氧/复氧干预;⑤缺氧/复氧+脂联素+AraA组（H/R+APN+AraA组）:加入终浓度分别为30μg/ml脂联素和1 mmol/L AraA与心肌细胞孵育24h后,进行缺氧/复氧干预;⑥缺氧/复氧+AraA组（H/R+AraA组）:加入终浓度为1 mmol/L的AraA,心肌细胞预处理24h后,进行缺氧/复氧干预。实验终止后,在倒置相差显微镜下观察各组心肌细胞形态及自发搏动情况,透射电镜观察细胞超微结构,并通过琼脂糖凝胶电泳和流式细胞术检测各组细胞凋亡情况,同时采用硫代巴比妥比色法与黄嘌呤氧化酶法分别测定细胞丙二醛（MDA）含量及培养液中超氧化物歧化酶（SOD）活性。结果:1.细胞鉴定:倒置显微镜下可见细胞成簇生长,有规律的自发性搏动,频率约90～120次/分。荧光倒置显微镜下可见胞浆内呈现绿色荧光,即胞浆内表达α-肌动蛋白与肌钙蛋白cTnT,符合心肌细胞的特征。2.各组心肌细胞形态学比较:H/R组细胞生长状态较差,电镜下可见染色质边集、凋亡小体等凋亡特征性改变,细胞搏动频率较空白组明显降低（19.50±3.39 vs 99.83±4.22beat/min,p＜0.05）;而H/R+APN组（94.33±3.93 beat/min）多数细胞结构接近正常,少数有染色质轻度边集、核深染等形态学变化,细胞搏动频率较快,与H/R组相比有显著性差异（p＜0.05）;H/R+APN+AraA组搏动频率较H/R+APN组明显减慢,有显著性差异（p＜0.05）。H/R+AraA组搏动频率为7.36±2.79 beat/min,与H/R组差异显著（p＜0.05）。APN组细胞生长良好,搏动频率与空白组相比有显著差异（122.09±3.67 vs 99.83±4.22beat/min,p＜0.05）。3.琼脂糖凝胶电泳细胞DNA结果分析:空白组与APN组DNA电泳呈一条大分子DNA片断,为正常基因组DNA带形;H/R组DNA则表现为明显的非随机降解状态,在电泳中呈特征分布,即凋亡独有的“梯状图谱”;H/R+APN组DNA梯状条带消失,接近正常基因组DNA带形;H/R+APN+AraA组与H/R+AraA组亦表现为梯状条带。4.各组心肌细胞凋亡百分率的比较:H/R组的DNA直方图表现为在G0/G1峰前出现一个DNA含量减少的亚二倍体峰（又称细胞凋亡峰）,细胞凋亡率较空白组明显增高（48.43±4.18%vs 2.30±0.89%,p＜0.05）;而H/R+APN组凋亡率与H/R组相比明显降低,有显著性差异（10.93±2.47%vs 48.43±4.18%,p＜0.05）;H/R+APN+AraA组细胞凋亡率为53.32±1.56%,与H/R+APN组差异显著（p＜0.05）;H/R+AraA组细胞凋亡率达69.89±0.72%,与H/R组有显著性差异（p＜0.05）。APN组凋亡率较空白组明显降低,有显著性差异（1.06±0.46%vs 2.30±0.89%,p＜0.05）。5.各组细胞MDA含量及培养液中SOD活性的比较:H/R组MDA较空白组明显升高（2.94±0.78 vs 0.90±0.12 nmol/L,p＜0.05）,而SOD活性显著下降（28.30±19.87 vs 58.63±22.03NU/ml,p＜0.05）;H/R+APN组MDA为1.23±0.51nmol/L,SOD为51.45±22.34 NU/ml,均与H/R组有显著差异（p＜0.05）。APN组与空白组比较无明显差异（p＞0.05）。结论:1.脂联素可以减轻缺氧/复氧导致的心肌细胞凋亡。这一作用可以被AMPK特异性抑制剂AraA部分阻断。2.脂联素对正常培养的心肌细胞同样具有抗凋亡作用。3.脂联素可以减轻缺氧/复氧脂质过氧化,保护心肌细胞SOD活性,在心肌细胞缺氧/复氧中具有抗氧化应激的作用。

论文目录

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