沙利度胺、5-氟脲嘧啶对胃癌细胞的作用及其机制的研究

论文摘要

背景胃癌在我国的发病率和死亡率在各种恶性肿瘤中居首位,由于胃癌早期并无特异性表现,发现时大多数病人已处于中晚期。胃癌的治疗效果差强人意,化疗是目前治疗胃癌的主要手段之一,近年来虽然开发研制了不少抗肿瘤新药,但于胃癌时有效的很少,5-氟脲嘧啶（5-Fu）仍是胃癌化疗的主要药物之一。临床上常通过加大药物的剂量或多药物联合来增加敏感性,但由于胃癌对化疗药物大多为低敏感性,故虽然高剂量药物在一定程度上能提高疗效,然而剂量增大对正常组织（如骨髓、心脏及肝脏等）的毒性也会增加,耐受性降低使疗效反而得不到提高,因而对胃癌患者的化疗中,适量联合使用其它类药物通过协同作用于肿瘤细胞,减少化疗药物临床用药剂量,降低其副作用,一直是肿瘤药物治疗的研究热点之一。沙利度胺（商品名:反应停）作为早孕反应的治疗药物曾因引起胎儿肢体和内脏畸形而退市,但新的研究发现沙利度胺有抗血管生成和免疫调节及诱导凋亡作用,使该药物重新得到重视,并已用于炎症和肿瘤性疾病。现在对沙利度胺的作用机制仍所知甚少。本研究的目的是探讨沙利度胺单药、5-Fu单药及沙利度胺和5-Fu联合应用对MGC-803细胞株的抑制增殖、诱导凋亡的作用及对凋亡相关基因表达的影响。方法首先做出不同密度细胞的标准生长曲线,采用1×103、1×104、5×104、1×105、1×106/ml不同密度的MGC-803细胞接种于96孔板,每孔100μl,设6个复孔,次日加入100μl培养液作为模拟加药开始计时,于24、48、72、96、120小时动态进行MTT检测,选出观察时间内适宜的初始接种密度。根据第一步实验的结果,以后的实验组均采用4×104/ml密度接种,次日加入实验用药开始计时,于24、48小时进行MTT检测。根据预实验结果及所加药物的不同,实验组分为5个沙利度胺单药组,培养体系中药物浓度分别为6.25、12.5、25、50、100μg/ml（其中二甲基亚枫（DMSO）作为沙利度胺的溶剂,在培养体系中最大浓度为0.1%）;4个5-Fu单药组,培养体系中药物浓度分别为6.25、12.5、25、50μg/ml;4个联合用药组,培养体系中药物浓度分别为5-Fu 25μg/ml+沙利度胺50μg/ml组、5-Fu 25μg/ml +沙利度胺100μg/ml组、5-Fu 12.5μg/ml+沙利度胺50μg/ml组、5-Fu 12.5μg/ml+沙利度胺100μg/ml组;空白对照组仅加入含0.1%DMSO的培养液代替药物作用于细胞,另设不加细胞的试剂对照以排除各种试剂对MTT检测的影响,各组均设4个复孔。用药后采用活细胞倒置相差显微镜观察、HE染色法光学显微镜观察、丫啶橙（AO）/溴化乙锭（EB）染色荧光显微镜观察MGC-803细胞的形态学变化,MTT法、流式细胞术（FACs）定量检测沙利度胺单药、5-Fu单药及二者联合应用对MGC-803细胞株的抑制增殖、诱导凋亡作用,免疫细胞化学法检测凋亡相关基因—过氧化物酶体增殖剂活化受体（PPAR—γ）和Bcl—2表达的变化。结果在72小时之内,细胞初始接种密度为1×103-5×104/ml时,随时间延长,细胞呈线性关系生长,均为本实验适宜的细胞初始接种密度,为细胞制悬时计算方便,最终选择4×104/ml为实验用96孔板的细胞初始接种密度。细胞初始接种密度为1×103/ml时,细胞在120小时内呈良好的线性关系生长,可用以长时间的研究。在倒置相差显微镜下,细胞数随沙利度胺、5-Fu的浓度增加而减少,双药联合组细胞数减少更明显,上清液混浊,贴壁细胞欠透亮,可见凋亡细胞,其胞质固缩,体积明显缩小,整体呈圆形或不规则形,细胞核染色质浓缩及破碎;在光学显微镜下观察HE染色的爬片可见,实验组中的细胞因增殖受抑制而稀疏,可见凋亡细胞,其胞质固缩,体积明显缩小,整体呈圆形或不规则形,细胞核染色质浓染或形成染色质块,染色质块凝集在核的边缘呈半月形或相互分离形成多个核碎片,有的细胞膜起泡脱落形成凋亡小体;荧光显微镜下,沙利度胺、5-Fu各浓度组和双药联合组均见凋亡细胞,细胞呈固缩状或圆珠状,染色质呈橘红色凝集分布于核膜内侧,可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。在MTT分析中,在沙利度胺单药组,不同浓度沙利度胺均可抑制MGC-803细胞株增殖,且细胞增殖受抑率随药物浓度的增高和时间的延长而上升,24小时时各组细胞增殖受抑率0.7%、1.4%、5.6%、15.0%和18.1%,48小时时各组细胞增殖受抑率0.8%、2.7%、7.3%、14.7%和18.9%,药物浓度≥125μg/ml的各组与对照组相比有显著性差异（P＜0.05,P＜0.01）,沙利度胺6.25μg/ml、12.5μg/ml组与对照组相比无显著性差异（P＞0.05）,两组之间亦无显著性差异（P＞0.05）;其中药物作用24小时时,沙利度胺50μg/ml、100μg/ml组之间无显著性差异（P＞0.05）,但延长作用至48小时时,二者之间出现显著性差异（P＜0.05）。在5-Fu单药组,药物作用24小时与48小时时,细胞增殖受抑率在各浓度组与对照组相比均有显著性差异（P＜0.01）,其中药物作用24小时时,各组两两比较时6.25μg/ml与12.5μg/ml组、25μg/ml与50μg/ml组无显著性差异（P＞0.05）,但作用至48小时时,各组两两比较均出现显著性差异（P＜0.01）。在联合用药组,在5-Fu剂量均为25μg/ml时,联合用药组与相应的5-Fu单药组相比均出现显著性差异（P＜0.01）,但两个联合用药组之间无显著性差异（P＞0.05）;在5-Fu剂量均为12.5μg/ml时,联合使用沙利度胺50或100μg/ml时与5-Fu 25μg/ml单药组相比均无明显差别（P＞0.05）。在FACs中沙利度胺组药物浓度分为12.5、50μg/ml,5-Fu组为25μg/ml,联合用药组为5-Fu25μg/ml+沙利度胺50μg/ml,空白对照组为含DMSO0.05%的培养液代替药物,以上各组凋亡率分别为3.31%、6.7%、13.3%、19.2%、1.05%,各实验组与空白对照组相比,凋亡率均有显著性差异（P＜0.01）,各实验组两两比较,凋亡率亦均有显著性差异（P＜0.01）。在免疫细胞化学染色分析中,应用沙利度胺12.5、50μg/ml、5-Fu 25μg/ml、5-Fu 25μg/ml+沙利度胺50μg/ml作用于MGC-803细胞株48小时后,与空白对照组相比PPAR—γ表达增加,Bcl—2表达减少（P＜0.01）,联合用药组和单药组之间亦有显著性差异（P＜0.01）。结论沙利度胺单药、5-Fu单药对MGC-803细胞株均有抑制增殖和诱导凋亡作用,两种药物联合应用时,其作用明显增强,而且联合使用沙利度胺时可降低5-Fu的使用剂量。意义沙利度胺对血管生成的抑制作用已被广泛关注,对实体瘤诱导凋亡的作用正处于研究热点之中。虽然沙利度胺的作用机制仍不是很清楚,但实验研究都显示该药能有效抑制肿瘤的生长、侵袭和转移,并取得了令人鼓舞的结果。沙利度胺无骨髓抑制作用,与化疗药物联合应用可以提高疗效,尽管沙利度胺对各种肿瘤的疗效并不一致,相信随着人们对其作用机制、抗瘤范围、应用条件和联合用药等方面的逐步掌握,沙利度胺治疗的病种将逐渐扩增。本实验采用MTT分析、免疫组化染色分析、FACs及形态学观察等技术手段多角度研究沙利度胺对MGC-803细胞的增殖抑制作用和诱导凋亡作用,并对其作用机理做初步探讨,阐明沙利度胺与MGC-803细胞的关系,并探讨沙利度胺的作用机制是否与PPAR—γ相关,可填补国际和国内空白,并为沙利度胺用于实体瘤治疗拓展新的思路。

论文目录

• 中文摘要
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• 材料和方法
• 结果
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• 结论
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