论文摘要
磷脂酰胆碱（phosphatidylcholine,PC）也称卵磷脂（lecithin）。系统名称为1 , 2-二酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱（ 1,2-diacyl-sn-glycero- 3-phosphocholine）。诸多实验结果已经证明,PC不但参与维持生物膜正常的结构和功能,与细胞的生长、增殖、分化及癌变密切相关,其降解产物还参与细胞的信号转导和代谢调控,具有防衰老、降血脂、健脑、保肝、抗肿瘤等多种生理作用。缩醛磷脂酰胆碱（plasmanylcholine,plas-PC）属于PC中的一类较为特殊的分子种,是一族醚甘油酯,结构中甘油骨架sn-1位置上含顺-α,β-不饱和醚（O-顺-α,β-烯醚键）（vinyl ether bond）,主要存在于某些动物组织和单细胞生物中。它们是真核生物细胞膜的重要组分之一,其含量因组织细胞的特异性不同而有所不同。Plas-PC具有诸如介导细胞的融合,参与离子跨膜转运及胆固醇的运输,作为细胞第二信使的储存库等重要的生物学功能,其抗氧化和抗癌作用已经越来越受到了人们广泛的关注。我们实验室前期的研究表明,肝中催磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine,PE）甲基化生成PC的磷脂酰乙醇胺甲基转移酶（PEMT）过表达能显著抑制肝癌细胞的生长并诱发凋亡,提示肝源PC可能具有抑制细胞增殖的作用。为了进一步研究肝源性磷脂酰胆碱的生理作用,开发其保健和医疗功效,本文重点研究了肝源性卵磷脂的工业化分离纯化方法和流程,分析了肝源性卵磷脂及其特异的缩醛卵磷脂分子种的结构,探讨了其可能的生物学功能。首先,建立了氧化铝柱色谱分离肝脏PC的简易方法。通过实验我们首次证明,以95%乙醇洗脱φ15mm的Al2O3色谱柱,可以实现肝脏磷脂诸多成分的分离,尤其是肝源性PC与PE的完全分离,并且在初步优化的实验室放大工艺条件下也达到了理想的分离效果,得到的PC纯度达到90%以上,为PC的工业化生产提供了技术支持。其次,利用MTT法测定了12.5μmol/L、25μmol/L、50μmol/L PC及plas-PC对大鼠肝癌CBRH-7919细胞增殖的影响并与人白血病K562细胞作了比较。结果表明:（1）肝源PC及plas-PC对大鼠肝癌CBRH-7919细胞的抑制作用明显高于K562细胞,并且存在时间剂量依赖关系;（2）由柱色谱获得的肝源PC对癌细胞的增殖抑制作用具有组织特异性,并且对特异癌细胞的增殖抑制存在时间剂量依赖性。第三,建立了反相高效液相色谱法（reversed-phase high performance liquid chromatography ,RP-HPLC）分离纯化肝源PC分子种的有效方法。考察了流动相中有机溶剂的种类、配比及流速对分离肝源性PC的影响。研究发现,在以甲醇为主的流动相中加入正己烷和醋酸铵有利于肝源性PC分子种的分离;甲醇-乙腈-水梯度洗脱不适于分离肝源性PC分子种。结果表明,采用Kromasil C18色谱柱（4.6mm×200mm,i.d.,5μm）,以甲醇-正己烷-0.05mol/L醋酸铵-甘油（84:6:8:0.6,体积比）为流动相,在流速1.0ml/min、检测波长206nm、柱温35℃的条件下,实现了肝源性PC各组分的分离。所建立的方法灵敏,重复性高,为进一步采用液质连用技术研究肝源性PC不同分子种的结构奠定基础。第四,根据HPLC的分离结果,进一步对plas-PC的结构进行了鉴定。首先采用上述分离系统运用标准品初步确定plas-PC的保留时间为19.11min;然后收集肝脏plas-PC进行红外检测;最后采用Quattro Micro Tandem MS/MS系统对plas-PC进行ESI+分析,结果表明:采用以下实验条件,毛细管电压:3.00kV,锥孔电压:25V,离子源温度:120℃,脱溶剂气温度:350℃,质量范围:100～1000m/z,光电倍增器电压:650V,锥孔气体流速:0.83 L/min,溶解气体流速:6.7L/min,获得了plas-PC准确的分子结构信息。结果提示,本实验分析的肝脏plas-PC分子量为794Da,结构为sn1-18:0（O-烃基）,sn2-20:4（O-酰基）。结论:（1）通过柱色谱法获得的肝源性磷脂酰胆碱,纯度可以达到90%以上;（2）肝源性PC能够显著抑制肝癌细胞的增殖;（3）肝源性PC的重要成份Plas-PC的分子量为794Da,sn1-18:0（O-烃基）,sn2-20:4（O-酰基）。