钩端螺旋体外膜脂蛋白LipL32的克隆、表达及其在钩端螺旋体抗体检测中的应用

论文摘要

钩端螺旋体病（简称钩体病）是由致病性钩端螺旋体（简称钩体）引起的一种人兽共患的自然疫源性疾病。钩体血清型别众多,临床表现多种多样。目前钩体病血清学的主要检测方法是国家标准即显微镜凝集试验（MAT）,需要培养各种血清型的钩体活菌,操作繁琐,安全性差且需要暗视野显微镜,无法在基层开展该项目的检测工作。钩体外膜脂蛋白LipL32是各种致病性钩体中高度保守的抗原成份,可刺激机体产生中和抗体。因此该抗原有可能应用于抗体检测。本课题用PCR法扩增致病性钩端螺旋体黄疸出血群（56601株）LipL32蛋白的全长基因片段,与表达载体pET-3Oa（+）连接并在大肠杆菌BL21（DE3）中表达重组蛋白,Western blot鉴定免疫活性后用电洗脱法进行纯化。纯化后的LipL32重组蛋白用间接ELISA和夹心ELISA法对不同的人和动物血清进行检测,以MAT为参照标准进行比较。主要结果如下:1.纯化的重组蛋白用间接ELISA和夹心ELISA法对致病性钩体15株标准菌株的兔免疫血清全部检出,对7株腐生性钩体菌株的兔免疫血清全部未检出,与MAT检测结果相符。表明该重组蛋白能区别腐生性和致病性钩体感染。进一步确证黄疸出血群（56601株）外膜脂蛋白LipL32基因在致病性钩体中高度保守。2.重组蛋白检测确诊钩体病人的9例急性期和恢复期双份血清标本,急性期9份血清,MAT有2份出现阳性,间接ELISA和夹心ELISA法分别可检出3份和2份阳性,进口ELISA检测试剂盒则是2份阳性,4份可疑。对于恢复期9份血清,MAT检出9份阳性,间接ELISA和夹心ELISA法均检出8份阳性,进口ELISA则是1份阳性,7份可疑。提示该重组蛋白包被的间接ELISA和夹心ELISA在钩体病检测方面与MAT相似,恢复期优于进口试剂盒。3.重组蛋白检测不同血清标本,45份MAT阳性标本,间接ELISA法敏感性为71.11%（32/45）,夹心ELISA敏感性为80.00%（36/45）,而进口ELISA试剂盒检测则是阳性13份,占28.89%（13/45）,25份可疑占55.56%（25/45）。在特异性检测方面,检测MAT阴性血清59份（其中健康体检血清43份,非钩体发热病人16份,包括恙虫病阳性和出血热阳性各8份）间接ELISA和夹心ELISA法特异度均为96.61%（57/59）,进口ELISA检测健康体检血清14份,均为阴性,检测非钩体发热病人16份,则出现1份阳性,12份可疑。对梅毒螺旋体质控阳性血清10份,四种方法均为阴性。证明该重组抗原在敏感性方面略高于进口试剂盒,特异性与MAT相同,大大好于进口试剂盒,在钩体流行病学大样本人群调查中可用于初筛。4.重组蛋白应用于夹心ELISA法检测鼠血清标本,以MAT为标准。检测274份标本,夹心ELISA的敏感性为86.75%（131/151）,特异性为99.19%（122/123）,符合率为92.34%（253/274）。结果表明夹心ELISA对鼠血清钩体抗体的检测显示较好的敏感性和特异性。夹心ELISA操作简单,特别适用于大样本钩体病现场血清流行病学宿主动物的调查。

论文目录

• 主要英文缩写词表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 研究生期间发表论文
• 致谢