黄盖鹅膏肽类毒素的分离纯化及抗肿瘤活性研究

论文摘要

本论文在对长白山产黄盖鹅膏（Amanita subjunquillea．S．lmai），进行野外生长环境调查、子实体形态观察和不同温度PDA培养基进行菌种分离实验等生物学特性研究的基础上，主要对该菌中的肽类毒素进行分离纯化，并进行了抗肿瘤活性的研究。生物学特性研究表明，每年8月到9月发生子实体，子实体黄色，具有菌环和菌托。子实体详细描述与杨祝良关于黄盖鹅膏的描述相同。黄盖鹅膏菌在PDA培养基不同温度培养条件下生长极其缓慢。应用高效液相色谱法，首次对黄盖鹅膏子实体不同干燥方法的甲醇粗提物进行检测，同时对甲醇粗提物进行毒素的分离和纯化。分别用A和B两种洗脱液不同配比进行分离。A和B两种洗脱液。洗脱液A相：10％乙腈+90％0.02M醋酸铵，冰醋酸调节pH值至5.0；洗脱液B相：30％乙腈+70％0.02M醋酸铵，冰醋酸调节pH值至5.0。洗脱梯度是：0→15min，B 0→5％，A 100％→95％；15→35min，B 5→80％，A 95％→20％，；35→40min，B 80％，A．20％；40～45minB．80→100％，A 20→0％；45～50minB．100％；50→55min，B 100→0％，A 0→100％并保持10min。研究结果表明，（1）阴干和冷冻干燥的子实体的毒素含量相同，干燥方法不影响其毒素含量。（2）分离纯化得到9种化合物，经液相色谱、电喷雾质谱和核磁共振鉴定6种化合物。化合物1～6分别为：β-鹅膏毒肽、α-鹅膏毒肽、羧基三羟鬼笔毒肽、三羟鬼笔毒肽、羧基二羟鬼笔毒肽和二羟鬼笔毒肽。化合物7和化合物8由于含量少，只测得分子量都为131，化合物9分子量为587，它们都不是已知的22种肽类毒素。采用孙氏综合法，以灌胃和腹腔注射两种给药途径，对黄盖鹅膏的甲醇粗提物进行急性毒性试验。结果显示以灌胃给药，剂量为600mg／kg，观察两周未见死亡，但是右眼均失明。采用腹腔注射给药，测得半数致死量是65.4mg／kg。两种给药途径均发现粗提物使昆明小鼠的肝脏有脂肪堆积。应用MTT法，检测黄盖鹅膏中分离的羧基三羟鬼笔毒肽和二羟鬼笔毒肽分别对SGC和SMMC-7721细胞增殖的抑制作用。所有数据采用SPSS14.0统计软件进行处理，结果表明羧基三羟鬼笔毒肽和二羟鬼笔毒肽，分别对SGC和SMMC-7721细胞增殖无抑制作用。首次选用H22荷瘤小鼠，对黄盖鹅膏甲醇粗提物和二羟鬼笔毒肽进行抗肿瘤体内实验，以腹腔注射给予受试药。所有数据采用SPSS14.0统计软件进行处理，结果表明鹅膏甲醇粗提物10mg／kg／d和20mg／kg／d具有较明显的抑制作用，抑瘤率分别为41.30％和43.48％，且具有一定的量效关系，和对照组相比无显著性差异。甲醇粗提物组与5-FU组相比小鼠体重明显增加。通过对免疫器官的检测，表明甲醇粗提物对胸腺和脾有明显增重的作用，说明对免疫器官有影响。二羟鬼笔毒肽对H22荷瘤鼠的肿瘤生长具有较高的抑制作用，且存在量效关系，不同药物剂量（0.15mg／kg／d和0.3mg／kg／d）抑瘤率分别为53.03％和65.15％，且具有一定的量效关系，与对照组对比具有显著性差异（p＜0.05）。二羟鬼笔毒肽和5-FU相比体重显著增加，与对照组和5-FU对比，二羟鬼笔毒肽能明显增加H22荷瘤小鼠胸腺重量，说明对免役器官有影响。但解剖未发现器官有明显变黑现象，说明其对免疫系统负面影响较小。总之，黄盖鹅膏甲醇粗提物应用高效液相分离纯化9种单体化合物，鉴定6种分别为β-鹅膏毒肽、α-鹅膏毒肽、羧基三羟鬼笔毒肽、三羟鬼笔毒肽、羧基二羟鬼笔毒肽和二羟鬼笔毒肽。采用孙氏综合法，腹腔注射给予受试药，测得甲醇粗提物半数致死量是65.4mg／kg。体外体内抗肿瘤实验，所有数据采用SPSS14.0统计软件进行处理。结果表明，体外抗肿瘤实验单体化合物羧基三羟鬼笔毒肽和二羟鬼笔毒肽，对SGC和SMMC-7721细胞增殖均无抑制作用。甲醇粗提物和单体化合物二羟鬼笔毒肽对H22荷瘤鼠有抗肿瘤活性，抑瘤率分别为43.48％和65.15％。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 第一章 鹅膏属的国内外研究进展
• 1.1 鹅膏属的分类研究进展
• 1.2 鹅膏毒素研究进展
• 1.3 鹅膏毒素提取、分离和纯化方法的研究进展
• 1.4 肽类毒素的检测
• 1.5 黄盖鹅膏研究进展
• 1.6 讨论
• 第二章 黄盖鹅膏的生物学特性
• 2.1 分类地位
• 2.2 野外观察与菌丝培养实验
• 2.3 野外调查结果
• 2.4 讨论
• 第三章 用HPLC分离纯化鉴定黄盖鹅膏中的肽类毒素
• 3.1 材料与仪器
• 3.2 实验方法
• 3.3 实验结果
• 第四章 黄盖鹅膏抗肿瘤活性的研究
• 50的测定'>4.1 粗提物LD₅₀的测定
• 4.2 抗肿瘤体外实验
• 4.3 抗肿瘤体内实验
• 4.4 小结与讨论
• 第五章 结论
• 5.1 结果
• 5.2 讨论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介