SARS冠状病毒Mc区的克隆表达及表达蛋白抗原活性研究

论文摘要

一、研究背景和目的 SARS冠状病毒（SARS-CoV）是一种新现的病原微生物,属于巢状病毒目（Order:Nidovirales）、冠状病毒科（Family:Coronaviridae）、冠状病毒属（Genus:Coronavirus）,基因组为单链正RNA。SARS-CoV可引起严重急性呼吸综合征（Severe Acute Respiratory Syndrome, SARS）,传染性强,死亡率高。首发病例于2002年11月出现在中国广东,疫情很快波及全球。目前,SARS暂时得到控制,但在SARS防治中许多关键问题尚待解决,如SARS-CoV入侵细胞及致病机制、特异性抗病毒药物、快速诊断试剂和疫苗的研制等。 研究表明,冠状病毒S蛋白（棘突蛋白）和M蛋白（膜蛋白）具有免疫原性,能够诱导中和抗体产生。M蛋白（membrane protein）是最丰富的结构蛋白,它跨膜双分子层3次,短氨基端在膜外,长羧基端在膜内,由121个氨基酸组成,被认为是与核蛋白体作用的区域。 本项研究分析了82株SARS-CoV M基因的变异情况,发现氨基酸变异主要发生在膜外和跨膜区域,膜内区域变异极少。对SARS-CoV M蛋白的B细胞抗原表位进行预测,结果表明M蛋白的B细胞抗原表位85%以上都位于M蛋白膜内区（Mc蛋白）。另有研究者预测,M蛋白所含T细胞激活表位主要集中在第81-220位氨基酸之间,占84.7%,即主要集中在Mc蛋白区域内。所以,就抗原活性而言,Mc蛋白应是M蛋白的代表区段,而且Mc蛋白的疏水性小于M蛋白的疏水性,更易于大量体外表达。因此,本项研究将靶蛋白锁定

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 SARS冠状病毒GD322株M基因序列测定及分析
• 1.1 材料
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 引物设计与合成
• 1.2.2 SARS冠状病毒GD322株RNA的提取
• 1.2.3 目的基因扩增
• 1.2.4 目的基因的纯化回收
• 1.2.5 目的基因克隆
• 1.2.6 M基因的序列测定及同源性分析
• 1.2.7 M基因的生物信息学分析
• 结果
• 讨论
• 小结
• 第二部分 SARS-CoV Mc区重组表达质粒的构建及鉴定
• 2.1 材料
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 Mc区片段的获取
• 2.2.2 目的基因克隆
• 2.2.3 酶切鉴定
• 2.2.4 PCR鉴定
• 2.2.5 表达载体的构建
• 2.2.6 重组表达质粒的筛选与鉴定
• 2.2.7 阳性重组克隆pET32a（+）／Mc的诱导表达及鉴定
• 2.2.8 免疫印迹（Western-Blot）检测表达蛋白
• 结果
• 讨论
• 小结
• 第三部分 SARS冠状病毒Mc蛋白的表达、纯化及复性
• 3.1 材料
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 表达产物可溶性的确定
• 3.2.2 目的基因表达条件的优化
• 3.2.3 表达产物的纯化
• 3.2.4 纯化蛋白复性
• 结果
• 讨论
• 小结
• 第四部分 SARS-CoV Mc蛋白抗原活性的初步研究
• 4.1 材料
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 复性蛋白免疫大白兔
• 4.2.2 Westen-Blot鉴定制备多克隆抗体的特异性
• 4.2.3 间接ELISA检测复性蛋白免疫原性并测定多抗效价
• 4.2.4 复性蛋白的耐热实验
• 4.2.5 复性蛋白与人血清反应
• 4.2.6 复性蛋白与兔抗229E、OC43血清反应
• 结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 缩略语词汇表
• 致谢
• 硕士期间发表论文情况
• 学位论文原创性声明
• 学位论文版权使用授权书