论文摘要
第一章非肌球蛋白重链9基因相关疾病家系收集、家系诊断和临床特点分析目的：收集一非肌球蛋白重链9基因相关疾病（MYH9-RD）家系患者的详细遗传资料。通过分析该MYH9-RD家系的临床特点、遗传方式和实验室特点来对该家系进行诊断,以探讨该家系MYH9-RD的致病机理。方法：登记家系所有成员并进行详细的临床体征检查和实验室检测。每一个家系成员进行临床体征包括白内障、神经性耳聋、异常出血、肾损害等检查及其它并发症调查和实验室评估等；分别采用自动血细胞计数仪法和手工法计数血小板数量,同时分析巨大血小板和包涵体的特点和百分率；应用染色体核型分析技术进行细胞学诊断；应用光学显微镜和电子显微镜观察中性粒细胞包涵体和血小板的形态特点和超微结构特点。结果：通过实验室评估和临床表现显示：该家系为常染色体显性遗传性MYH9-RD,外周血染色体核型分析正常。调查的该MYH9-RD家系4代32人中有15人患病。所有患者均具有典型的“血小板减少、巨大血小板和粒细胞包涵体”三联症,都有轻至中度的出血倾向,并且与血小板的数量或大小无关。而且大多数患者的临床表型高度复杂,其中一些患者还伴有严重的白血病、青光眼、心功能不全、转氨酶升高、血脂升高、哮喘、鼻炎及白内障等多种疾病,不同于目前国内外报道的家系。MYH9-RD家系患者机数血小板数明显低于镜数血小板数（P<0.01）。电镜下可见清晰的巨大血小板和包涵体的超微结构,包涵体电镜下的结构为椭圆形或梭形,位于中性粒细胞的边缘。此外,正常对照者血小板数量、形态和结构均正常,而且中性粒细胞中未见包涵体。结论：通过临床表现和实验室特点分析,该家系MYH9-RD诊断成立。该家系具有规模大、患者人数多、临床表型复杂多样的特点,是一个不同于目前国内外报道的大家系。该家系将为MYH9相关疾病的深入研究奠定基础。此外,为了正确反映巨大血小板患者的血小板数量,我们应使用人工计数法而不是细胞自动计数仪法来计数血小板的数量。笔二章MYH9-RD家系MYH9基因突变检测与分析目的：探讨和分析—MYH9-RD家系非肌球蛋白重链9（MYH9）基因的突变情况。方法：签定知情同意书后,采集患者和家系成员的外周血。应用聚合酶链反应和直接测序的方法对15例家系患者MYH9基因的全部40个外显子和侧翼区进行突变检测和分析,选择家系正常个体为对照。测序结果通过DNAMAN软件与Genebank中的正常MYH9基因序列进行比对。结果：家系患者MYH9基因的所有外显子与侧翼区均未检测到致病性突变,只有25号和18号外显子各有一同义突变。结论：本家系可能存在新的基因突变类型或此类疾病的另一个新的致病基因或其它原因,其临床表型复杂多样可能与此有关。对该家系的深入研究将对进一步阐明该遗传性疾病形成的分子机制具有重要的意义。第三章MYH9-RD家系非肌性肌球蛋白重链ⅡA在中性粒细胞中的定位与表达目的：观察该MYH9-RD家系患者非肌性肌球蛋白重链ⅡA （nonmuscle myosin heavy chain-ⅡA, NMMHC-ⅡA）在中性粒细胞中的定位和表达,阐明MYH9-RD中性粒细胞包涵体的性质和形成特点,以探讨MYH9-RD的致病机制。方法：分离MYH9-RD患者和正常对照者外周血中性粒细胞。应用免疫荧光染色技术,观察MYH9-RD患者与正常对照者NMMHC-ⅡA在胞浆中的分布情况；应用Westernblot技术分析MHY9-RD中患者和正常对照者之间NMMHC-ⅡA蛋白的表达水平。结果：MYH9-RD患者中性粒细胞胞浆中存在“椭圆形及梭形”包涵体的形态和轮廓,与瑞特姬姆萨染色显示的包涵体形状、大小基本一致,但更为清晰；而正常对照中性粒细胞胞浆中的荧光呈弥散分布,无丛集现象,未见包涵体；Westernblot结果显示患者NMMHC-ⅡA含量较正常对照降低。结论：免疫荧光技术和Westernblot技术均显示患者和正常人之间MYH9基因编码蛋白NMMHC-ⅡA在中性粒细胞中的表达和分布存在异常,提示NMMHC-ⅡA的显性负性效应导致了中性粒细胞包涵体的产生,表明本家系MYH9-RD患者中性粒细胞包涵体的主要构成成份和性质是非肌性肌球蛋白ⅡA, NMMHC-ⅡA是本家系致病机理的一个重要方面。虽然本家MYH9基因40个外显子和侧翼区未检测到致病性突变,但本家系的致病基因有可能还是由MYH9基因异常导致的。同时,免疫荧光染色技术较瑞特姬姆萨染色法更敏感,特异性更强,对诊断MYH9-RD具有重要的意义。第四章MYH9-RD家系血小板中NMMHC-ⅡA和膜糖蛋白的检测与分析目的：通过分析该MYH9-RD家系患者血小板膜糖蛋白表达差异和NMMHC-ⅡA在血小板中的分布特点,来进一步探讨该家系血小板与MYH9-RD之间的致病机理。方法：采取家系患者和正常对照者的外周血,并分离血小板。应用流式细胞术对MYH9-RD家系患者与正常个体之间的血小板膜糖蛋白GPⅡb/IIIa（CD41/61）、GP I a（CD49b）、GP I b/IX/V （CD42a） GPⅠb（CD42b）和GPⅣ（CD36）进行检测,运用免疫荧光方法观察NMMHC-ⅡA在正常人和患者之间的分布。结果：家系患者血小板膜糖蛋白GPⅡb/Ⅲa（CD41/61）、GP I a（CD49b）、GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ（CD42a） GPⅠb（CD42b）和(GPIV（CD36）检测结果正常,血小板膜糖蛋白表达量在家系患者和正常对照者之间,无统计学意义（P>0.05）；但家系患者个体之间血小板的活化水平不同。免疫荧光结果显示患者血小板中NMMHC-ⅡA在血小板中央区染色分布均匀,但是在血小板的外围染色较密集；而正常人结果显示NMMHC-ⅡA在血小板中是呈均匀分布的。结论：家系患者中血小板中NMMHC-ⅡA蛋白分布存在异常,提示家系患者巨大血小板的形成可能与NMMHC-ⅡA异常分布有关；虽然家系患者和正常个体之间的血小板膜糖蛋白表达没有差异,但是家系患者之间血小板的活化水平差异却较大,提示MYH9-RD本家系患者临床表型复杂多样可能与血小板活化水平相关。
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