人乳腺癌细胞MCF-7紫杉醇耐药细胞株的建立及其耐药机制的研究

论文摘要

肿瘤多药耐药是导致临床肿瘤化疗失败的主要原因之一,肿瘤多药耐药模型的建立及其性质的研究,对肿瘤治疗的顺利进行具有十分重要的意义。本论文主要通过建立两株肿瘤多药耐药模型,测定其较为完备的耐药谱,对其各项生物学特性进行比较研究,并通过亲和甄别磁珠法寻找药物结合蛋白,有望找到新的药物靶点。一方面为临床用药提供参考,同时也为从分子蛋白质水平分析耐药细胞的各项机制提供依据。本论文分别采用低浓度加量持续诱导法和高浓度短期作用法建立人乳腺癌MCF-7细胞的耐紫杉醇模型,分别将其命名为MCF-7/Taxola和MCF-7/Taxolb。其主要的生物学特性,包括体外耐药性、动力学周期分布、表型变化、侧群细胞变化、胞内药物蓄积等,在本实验中作了较为全面和详细的研究。体外耐药谱分析表明,MCF-7/Taxola和MCF-7/Taxolb细胞的紫杉醇半数抑制浓度（IC50）分别是亲代MCF-7细胞的525倍和330倍,并且都对多种化疗药物交叉耐药;细胞周期分析表明,MCF-7/Taxola细胞S期细胞显著增加,G1期细胞减少,MCF-7/Taxolb细胞各个期变化不大;免疫组化分析表明,MCF-7/Taxola细胞P-gp、LRP和GSTπ的表达水平较亲代有显著增加,而MCF-7/Taxolb细胞GSTπ的表达水平较亲代也有显著增加,两株细胞ER、PR阳性都表达丢失;光镜下耐药细胞MCF-7/Taxola明显变大并且形态不规则,而MCF-7/Taxolb变化不大;电镜下MCF-7/Taxola表面纤绒毛成小球状隆起和絮状,而MCF-7/Taxolb表面成絮状;侧群细胞分析表明,MCF-7/Taxolb细胞内侧群细胞的含量远高于亲本细胞和MCF-7/Taxola细胞;通过HPLC法,在稳定生长的模型MCF-7/Taxola中撤药培养10天的细胞内仍可以检测到Taxol的蓄积。和传统MDR机制研究方法不同,本论文借助生物素-亲和素系统,采用亲和甄别磁珠法筛选直接获得能与紫衫醇特异性结合的多肽和靶点蛋白,以细胞内药物结合蛋白为研究对象,分析亲本和耐药细胞中紫衫醇特异性结合的差异蛋白信息,SDS-PAGE银染MCF-7/Taxola主有一缺失条带,蛋白测序主要涵盖Heat shock protein、Actinin、Dermcidin precursor、Hornerin等共计25种蛋白,其中有2种蛋白已经成为抗肿瘤新药研究的靶点,其它蛋白暂无和肿瘤耐药研究的相关报道,不过这些蛋白中有些归属信号通路相关蛋白,很可能成为新的肿瘤耐药靶点蛋白。本实验所建立的两株耐药模型具有多药耐药细胞的基本生物学特性,可用于肿瘤多药耐药机制的研究,各项实验结果提示模型MCF-7/Taxolb细胞可能是模型MCF-7/Taxola细胞的亚群,同时,模型MCF-7/Taxolb耐药细胞株中可能含有大量MCF-7的肿瘤干细胞。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪言
• 1.1 背景
• 1.1.1 肿瘤治疗的方法和化疗药物
• 1.1.2 肿瘤多药耐药的产生
• 1.1.3 肿瘤多药耐药机制
• 1.1.4 肿瘤多药耐药的处理方法
• 1.1.5 体外多药耐药模型建立的意义和方法
• 1.2 课题研究的意义
• 1.3 课题研究的内容
• 第二章 两株人乳腺癌细胞MCF-7 紫杉醇耐药模型的建立
• 2.1 实验材料、仪器
• 2.1.1 试验材料
• 2.1.2 实验试剂
• 2.1.3 实验仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 细胞培养液
• 2.2.2 细胞培养配置
• 2.2.3 磺酰罗丹明B（Sulforhodamine B, SRB）染色法
• 50 的检测'>2.2.4 阿霉素对MCF-7/S 细胞的生长抑制率及IC₅₀的检测
• 2.2.5 耐药细胞模型的建立
• 50 及耐药指数'>2.2.6 紫杉醇作用于耐药细胞的IC₅₀及耐药指数
• 2.2.7 耐药细胞耐药稳定性的测定
• 2.2.8 细胞内Taxol 聚积的鉴定
• 2.2.9 数据分析
• 2.3 实验结果
• 50'>2.3.1 不同浓度紫杉醇对MCF-7/S 细胞生长抑制率和IC₅₀
• 50'>2.3.2 紫杉醇对两株耐药细胞的IC₅₀
• 2.3.3 耐药细胞的耐药稳定
• 2.3.4 耐药细胞中紫杉醇蓄积的鉴定
• 2.4 讨论
• 2.5 本章小结
• 第三章 耐药细胞多药耐药谱的分析
• 3.1 实验材料、仪器
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 实验试剂
• 3.1.3 实验仪器
• 3.2 实验方法
• 3.3.1 细胞培养
• 3.2.2 药物浓度梯度的选择
• 3.2.3 各种药物对MCF-7/S 和耐药细胞的药敏性的测定
• 3.2.4 数据分析
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 耐药谱的测定
• 3.4 讨论
• 3.4.1 耐药指数的分析
• 3.4.2 作用机制分析
• 3.5 本章小结
• 第四章 耐药细胞的生物学特性研究
• 4.1 实验材料、仪器
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 实验试剂
• 4.1.3 实验仪器
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 MCF-7/S 和耐药细胞的生长曲线和和倍增时间
• 4.2.2 MCF-7/S 和耐药细胞在低营养条件下的生长情况
• 4.2.3 形态学观察
• 4.2.4 流式细胞术（FCM）分析细胞周期分布
• 4.2.5 免疫细胞化学法检测肿瘤细胞耐药相关蛋白的表达情况
• 4.2.6 侧群（Side Population, SP）细胞的检测
• 4.2.7 数据分析
• 4.3 实验结果
• 4.3.1 MCF-7/S 细胞和耐药细胞的生长曲线和倍增时间
• 4.3.2 MCF-7/S 细胞和耐药细胞在低营养条件下的生长情况
• 4.3.3 形态学分析
• 4.3.4 细胞周期分布
• 4.3.5 肿瘤细胞生化标志物的表达情况
• 4.3.6 细胞侧群的分布
• 4.4 讨论
• 4.5 本章小结
• 第五章 肿瘤多药耐药机制的研究
• 5.1 实验材料、仪器
• 5.1.1 实验材料
• 5.1.2 实验试剂
• 5.1.3 实验仪器
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 生物素化紫杉醇的合成及其制备
• 5.2.2 生物素化紫杉醇的活性鉴定
• 5.2.3 生物素化紫杉醇和亲和甄别磁珠的偶联
• a 细胞的收集、裂解、蛋白提取'>5.2.4 MCF-7/S 和MCF-7/Taxol^a细胞的收集、裂解、蛋白提取
• 5.2.5 亲和甄别磁珠的生物淘洗
• 5.2.6 SDS-PAGE 分离、纯化和银染
• 5.2.7 LC－MS/MS 测序比对分析
• 5.2.8 数据分析
• 5.3 实验结果
• 5.3.1 化学合成反应液的HPLC-MS 分析鉴定及其生物素化紫杉醇的制备
• 5.3.2 生物素化紫杉醇的活性鉴定
• 5.3.3 银染比较生物素化紫杉醇的结合蛋白
• 5.3.4 两株细胞中紫杉醇结合的差异蛋白序列分析
• 5.4 讨论
• 5.5 本章小结
• 第六章 总结与展望
• 6.1 课题总结
• 6.2 课题发展方向
• 致谢
• 参考文献
• 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文