14-3-3蛋白在人脑胶质瘤的定量研究及意义

论文摘要

侵袭性脑胶质瘤是一类常见的原发性恶性中枢神经系统肿瘤,在成人其发生率约占颅内肿瘤的50%。不论成人还是小孩,绝大部分这类肿瘤的预后均欠佳,其中恶性程度最高的多形性胶质母细胞瘤患者,即使手术后接受放疗、化疗等系统性治疗,其中位生存期也仅为1年。在胶质瘤的发生、发展中有多种基因的连锁改变,这些改变最终使肿瘤细胞获得无限增殖的生长优势,从而促进肿瘤的发生和发展。因此,发现人脑胶质瘤发生和进展中改变的特异性基因并阐明其作用机制将有助于制定更加有效的治疗策略。14-3-3蛋白是一类高度保守的小分子多功能酸性二聚体蛋白。它们是在上世纪60年代一项有关脑蛋白的研究中发现的,并依据其在DEAE-纤维素层析中的组分和在淀粉-凝胶电泳中的迁移位置而命名。最初发现这类蛋白只在神经元中有大量的表达,但随后的研究发现它们存在于所有真核生物体中。目前,已发现该类蛋白在哺乳类包含由不同基因编码的7个亚型（β,η,ζ,ε,θ/τ,γ和σ）。近来在多种肿瘤的研究中发现14-3-3蛋白能与200多个配体分子相结合,在多种细胞生理和病理过程中起重要作用,并参与了肿瘤的发生和进展,如细胞增殖、分化、信号转导,凋亡,细胞周期调控以及肿瘤血管形成等。我们先前的研究发现14-3-3蛋白在人脑胶质瘤及胶质瘤细胞系中有大量的表达,其上调表达与弥漫性侵袭性胶质瘤的恶性程度相关。到目前为止,在人脑胶质瘤中是否特异性存在14-3-3蛋白的某个或某几个亚型,及各亚型的表达情况尚未见报道。基于此,本课题从以下几个方面进行了探讨。1.14-3-3蛋白各亚型在人脑胶质瘤中的表达:采用Western blot检测14-3-3蛋白各亚型在5个胶质瘤细胞系（U251、U87、BT325、SHG44和U118）及1个正常胶质细胞系SVGp12的表达,并进行半定量分析。结果显示:14-3-3β和η表达于以上5个胶质瘤细胞系中,而在正常胶质细胞系中未见表达。14-3-3ε、θ和ζ在5个胶质瘤细胞系和正常胶质细胞系中均有表达,但其在胶质瘤细胞系中的表达量均高于正常胶质细胞系中的表达量。14-3-3γ和σ在胶质瘤细胞系和正常胶质细胞系中均未见表达。采用Western blot检测24例胶质瘤组织和5例正常脑组织中14-3-3蛋白的表达情况,并与胶质瘤的恶性级别做相关性分析。结果发现:14-3-3β和η特异性的表达于胶质瘤组织,且其表达量随胶质瘤恶性级别的增加而升高（P<0.05）。14-3-3ε、θ和ζ在胶质瘤组织和正常脑组织中均有表达,但其在胶质瘤组织中的表达量均高于在正常脑组织中的表达量,并发现14-3-3ε和ζ的表达量随着胶质瘤的恶性级别的增加而升高（P<0.05）,而14-3-3θ在各级别胶质瘤之间的表达量却无显著性差异（P>0.05）。14-3-3γ和σ在胶质瘤组织和正常脑组织中均未见表达。2.14-3-3β亚型mRNA在人脑胶质瘤中的表达:采用RT-PCR检测24例胶质瘤组织和5例正常脑组织中14-3-3βmRNA水平,并做半定量分析。结果发现:14-3-3β特异性的表达于胶质瘤组织,且其表达在各级别之间有显著性差异（P<0.05）,并随肿瘤恶性级别的增加而升高。3.14-3-3β亚型蛋白在人脑胶质瘤细胞系中的表达采用免疫细胞化学ABC法检测正常胶质细胞系SVGp12、胶质瘤细胞系U251中的表达情况。结果显示:14-3-3β亚型的表达定位于正常脑组织中的神经元胞体和轴突和胶质瘤细胞的胞浆成分。14-3-3β在正常胶质细胞系SVGp12中无表达,而特异性的表达于胶质瘤细胞系U251中。综上所述,不论从细胞或组织,还是mRNA或蛋白水平,14-3-3β亚型都特异性的表达于胶质瘤组织,且其表达量随着胶质瘤恶性级别的增加而升高。它的表达上调可能是大多数胶质瘤发生和发展的机制之一。因此,14-3-3β亚型有望成为人脑胶质瘤基因治疗的一个新靶点。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言和文献回顾
• 1. 引言
• 2. 14-3-3 蛋白研究进展
• 3. 常用的蛋白定量研究方法
• 4. 常用基因 mRNA 定量研究方法
• 正文
• 实验一 14-3-3 蛋白各亚型在人脑胶质瘤中的表达
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 实验二 14-3-3Β亚型MRNA在人脑胶质瘤中的表达
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 实验三 14-3-3Β亚型蛋白在人脑胶质瘤细胞系中的表达
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 小结
• 参考文献
• 附图
• 个人简历和发表论文
• 致谢