论文摘要
慢性粒细胞白血病（CML）的发生是由于t（9；22）（q34；q11）所致的bcr/abl融合基因编码产生具有强烈酪氨酸激酶活性的BCR/ABL融合蛋白。该蛋白是CML细胞的胞内蛋白，属于肿瘤特异性抗原。如何有效递呈BCR/ABL融合蛋白至CML细胞膜表面从而持续诱导机体产生特异性细胞免疫并成为效应细胞毒性T细胞（CTL）的靶向分子，一直是国内外研究的热点。本课题以bcr/abl融合基因为靶点，利用糖基化磷脂酰肌醇（GPI）能将重组蛋白锚定于细胞膜上的特点，辅以IL-12细胞因子佐剂，构建由GPI锚定修饰的慢粒白血病bcr/abl和鼠IL-12（mIL-12）真核双表达载体pBudCE4.1-bcr/abl-GPI-mIL12，并探讨其免疫原性及体内抗白血病效应，旨在探索以bcr/abl融合基因为靶点的免疫治疗策略治疗CML的可行性。实验从四方面进行研究，其主要方法、结果及结论如下：1.构建由GPI锚定修饰的bcr/abl和mIL-12真核双表达载体pBudCE4.1-bcr/abl-GPI-mIL12（PBBGI），在COS-7细胞中检测其基因和膜蛋白表达水平：以含有CML（b3a2型）migP210全长序列的质粒为模板，通过PCR扩增获得654bp的bcr/abl融合基因片段，酶切后插入真核双表达载体pBudCE4.1中，经鉴定获得重组质粒pBudCE4.1-bcr/abl（PBB）。同时，RT-PCR扩增人外周血B淋巴细胞CD24锚定分子中的GPI信号肽序列，酶切后克隆入PBB质粒中与bcr/abl基因片段下游羧基端相连，获得重组质粒pBudCE4.1-bcr/abl-GPI（PBBG）并鉴定。然后扩增mIL-12基因片段并亚克隆入PBBG另一多克隆位点，构建重组质粒pBudCE4.1-bcr/abl-GPI-mIL12（PBBGI）。在多聚阳离子介导下将PBBGI质粒转染COS-7细胞，采用RT-PCR、Western blot检测转染细胞bcr/abl融合基因及细胞膜上BCR/ABL融合蛋白的表达，ELISA检测mIL-12细胞因子的表达。经酶切和测序鉴定证实，由GPI锚定连接的bcr/abl及mIL-12基因插入片段正确；转染的COS-7细胞中有bcr/abl融合基因、转染细胞膜上有BCR/ABL融合蛋白表达，转染细胞培养上清中也有IL-12的表达。2.建立细胞膜上能稳定表达BCR/ABL融合蛋白的SP2/0靶细胞株：通过脂质体介导将GPI锚定修饰的bcr/abl真核表达载体PBBG转染SP2/0小鼠骨髓瘤细胞，经匀霉素高压筛选及克隆化培养获得2株阳性克隆细胞。Western blot检测鉴定，SP2/0阳性克隆细胞膜上有BCR/ABL融合蛋白的稳定表达，可作为CML体外CTL水平检测的特异性靶细胞。3.真核双表达载体pBudCE4.1-bcr/abl-GPI-mIL12（PBBGI）诱导小鼠特异性细胞免疫应答：BALB/C雌性小鼠随机分成5组（每组5只），采用肌肉注射方式进行免疫，即①pBudCE4.1空载组、②PBB重组质粒组、③PBBG重组质粒组、④PBBGI重组质粒组、⑤PBS对照组。每隔10d注射1次，共计3次。末次免疫后30d，分离各组小鼠脾淋巴细胞，经ConA体外刺激培养，MTT法检测脾淋巴细胞刺激指数（stimulation index, SI）及CTL细胞杀伤活性；ELISA法检测细胞培养上清中IL-2、IFN-γ表达水平。结果表明，PBBG、PBBGI重组质粒免疫组脾淋巴细胞刺激指数SI、IL-2、IFN-γ表达水平及CTL细胞毒活性与PBB、pBudCE4.1免疫组及PBS对照组比较,均存在显著性差异（P<0.05）；PBBGI免疫组IL-2、IFN-γ表达水平、CTL杀伤活性也明显高于PBBG质粒组，差异具有统计学意义（P<0.05），但二者间SI无显著性差异。4.真核双表达载体pBudCE4.1-bcr/abl-GPI-mIL12（PBBGI）对CML模型鼠体内抗白血病效应研究：将pBudCE4.1空载及PBB、PBBG、PBBGI重组质粒作为基因疫苗通过肌肉注射方式分别免疫本课题组前期构建的bcr/abl逆转录病毒介导的小鼠CML骨髓转移/移植模型，每组3只，并以PBS为对照。每隔10d注射1次，共计3次。末次免疫后30d，取正常BALB/C小鼠及各免疫组模型鼠骨髓、脾脏及外周血，通过RT-PCR、Western blot检测骨髓细胞bcr/abl融合基因的转录水平及BCR/ABL融合蛋白的表达水平；通过脾脏病理切片，了解白血病细胞浸润情况；通过外周血白细胞计数及涂片分类，计数白细胞总数、粒系比例及幼稚细胞数量的变化。实验结果表明：PBBGI质粒免疫的CML模型鼠与PBBG、PBB及其它免疫组比较，骨髓细胞中bcr/abl融合基因及BCR/ABL融合蛋白的表达水平减弱；脾脏中CML细胞浸润程度明显减轻；外周血白细胞总数、粒系比例及幼稚细胞数量也呈下降趋势，差异有统计学意义（P<0.05）。通过上述实验可以得出以下结论：1.成功构建了由GPI锚定修饰的、能在真核细胞中表达bcr/abl和mIL-12的重组质粒pBudCE4.1-bcr/abl-GPI-mIL12（PBBGI），为我们后续研究bcr/abl融合基因诱导肿瘤特异性细胞免疫奠定了基础。2.建立了细胞膜上能稳定表达BCR/ABL融合蛋白的SP2/0靶细胞株，为体外检验bcr/abl融合基因激发小鼠特异性CTL应答提供了良好的实验工具和研究平台。3. GPI锚定修饰的bcr/abl和mIL-12真核双表达载体（PBBGI）具备免疫原性，能够诱导小鼠产生较高水平的细胞免疫应答，尤其是抗bcr/abl的特异性CTL应答。4. GPI锚定修饰的bcr/abl和mIL-12真核双表达载体能够缓解CML模型鼠白血病症状，抑制其白血病细胞生长，减轻致癌基因表达，使以bcr/abl融合基因为靶点的免疫治疗策略治疗CML具备了可行性。综上所述，本文以bcr/abl融合基因作为慢性粒细胞白血病免疫治疗靶点，成功构建了由GPI锚定修饰的bcr/abl和mIL-12真核双表达载体，并且证实了GPI的锚定修饰及IL-12细胞因子佐剂的协同作用能够明显增强bcr/abl融合基因诱导产生的特异性细胞免疫应答；同时该载体还能抑制CML模型鼠白血病细胞生长，减少致癌基因表达，显示出其潜在的肿瘤免疫治疗价值。
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标签：融合基因论文; 糖基化磷脂酰肌醇论文; 白细胞介素论文; 细胞免疫论文; 慢性粒细胞白血病论文;